曾建成 黃玉梅 陳鳳玲

（深圳市寶安區(qū)西鄉(xiāng)人民醫(yī)院肛腸外科 廣東深圳 518102）

神經(jīng)叢素（Plexins）是一種跨膜蛋白，是信號素（Semaphorins）家族的受體。Plexin Al是Plexins家族的一種亞型，具有多項潛在功能。以往對Plexin Al的研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生和發(fā)展方面，近年來研究發(fā)現(xiàn)Plexin Al在心血管形成、免疫反應、上皮細胞生長以及腫瘤生長中都發(fā)揮著重要的作用［1～3］。本研究將Plexin A1的研究引入了消化道常見的惡性腫瘤直腸癌中，通過RT-PCR和免疫組織化學方法檢測直腸癌中Plexin A1的表達，探討Plexin A1的表達與臨床病理因素之間的關(guān)系，為直腸癌的治療和診斷提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料 收集廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院及西鄉(xiāng)人民醫(yī)院直腸癌患者外科手術(shù)切除標本67例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例。所有的患者手術(shù)前均未接受過任何放療、化療，并且經(jīng)病理組織學證實。患者年齡分布在36～80歲之間，平均57±6歲，其中男39例，女28例。根據(jù)Duckes分期：A期16例，B期26例，C、D期25例。另取相應的癌旁組織（腫瘤邊緣5cm以上的無腫瘤組織）45例作為對照組。所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑 RT-PCR引物由上海生工生物公司設計并合成。逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒和普通PCR試劑盒購自TAKARA公司。Plexin A1多克隆抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，抗體工作濃度為1∶50，采用福州邁新公司免疫組化檢測試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 半定量RT-PCR （1）提取總RNA及逆轉(zhuǎn)錄：新鮮組織離體后，用Trizol法提取總RNA，溶于20μL DEP水中，使用核酸蛋白測定儀檢測總RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄體系為20μL，加入1.5μg總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書操作步驟進行逆轉(zhuǎn)錄反應。（2）PCR擴增及電泳：取1μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，使用PCR擴增試劑盒，在PCR儀上進行PCR擴增。以GADPH作為參照。RT-PCR引物由上海生工生物公司設計并合成。Plexin Al引物序列：上游引物5’-TGA CTG GAC AGA CTC CAA G-3’，下游引物 5’-GAA CAC AAT CTG GTA CTC C-3’。GAPDH引物序列為：上游引物5’-CAA CTA CAT GGT CTA CAT GTT CC-3’，下游引物5’-CAA CCT GGT CAG TGT AG-3’。PCR反應體為25μL，PCR反應條件為；94℃預變性5min，94℃變性50s，58℃退火50s（GAPDH為55℃，50s），72℃延伸l min，32個循環(huán)，72℃再延伸10min。取8μL PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳30min，凝膠成像儀觀察并拍照。

1.3.2 免疫組織化學 染色步驟采用SP法，詳細步驟按照說明書進行。主要步驟：將所有標本石蠟塊4μm厚石蠟切片常規(guī)脫蠟和水化，PBS（pH7.4）沖洗3次，每次3min；微波加熱抗原修復；每張切片經(jīng)3%H202消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；滴加正常山羊血清封閉，室溫下孵育30min；滴加Plexin A1多克隆抗體抗體（稀釋度1：50），4℃過夜；PBS沖洗3次，每次3min；滴加MaxVisionTM試劑，室溫孵育15min；PBS沖洗3次，每次3min；滴加DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，中性樹膠封固。

結(jié)果判定：Plexin A1蛋白主要定位于細胞質(zhì)和細胞膜，胞漿或者胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒則為陽性細胞。在高倍鏡下，隨機計數(shù)10個視野內(nèi)的陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù)，求出陽性細胞的百分率，并規(guī)定陽性細胞數(shù)大于或者等于10%為陽性，反之為陰性。

1.3.3 MVD計數(shù) MVD檢測方法參照Weidner［4］等報道的方法進行，第Ⅲ因子定位在血管內(nèi)皮上，每個組織位點隨機選取6個高倍視野，對微血管數(shù)計算，并計算其平均值作為MVD。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 11.3統(tǒng)計數(shù)據(jù)軟件包分析。定量資料以中位數(shù)表示，統(tǒng)計方法采用秩和檢驗，臨床病理特征組間Plexin A1表達情況的比較采用χ2檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 Plexin A1mRNA表達 RT-PCR檢測結(jié)果顯示，Plexin Al在直腸正常黏膜和直腸癌組織中均有表達，且Plexin Al在直腸癌癌組織中的表達明顯高于直腸正常黏膜中的表達（圖1）。提示，Plexin Al在直腸癌組織的表達升高。

圖1 Plexin A1在直腸癌中的表達

2.2 免疫組織化學檢測Plexin A1在直腸癌中的表達 免疫組化結(jié)果顯示Plexin A1蛋白主要定位于細胞質(zhì)和細胞膜，陽性染色為細胞質(zhì)和細胞膜出現(xiàn)棕色顆粒。如圖2所示，直腸癌組織中Plexin A1呈強陽性表達，癌旁的直腸正常黏膜中呈陰性表達，該結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致。

圖2 直腸癌組織中Plexin A1的表達（×200）

2.3 Plexin A1的表達與直腸癌臨床病理因素的關(guān) 系 我們對67例直腸癌患者中Plexin A1的表達進行了分析，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者42例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中Plexin A1高表達，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中Plexin A1表達較低（P＜0.05）。Plexin A1的表達與直腸癌Dukes分期有相關(guān)性，隨著Dukes分期的增加，Plexin A1表達也增加（P＜0.05）。此外，Plexin A1高表達的直腸癌組織MVD（51.03±8.71）顯著高于Plexin A1低表達的癌組織（41.26±11.39），Plexin A1的表達與 MVD成正相關(guān)（P＜0.05）。

表1 Plexin A1表達與臨床病理因素之間的關(guān)系

3 討 論

直腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。對于直腸癌的治療，目前主要是手術(shù)切除，然而相當多的患者在術(shù)后復發(fā)或發(fā)生轉(zhuǎn)移，這是直腸癌難以治愈并導致患者死亡的重要原因。直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移遠近等已被作為判斷患者預后的重要指標。目前對于直腸癌的早期診斷率較低，因此探索有效的診斷標志物對于直腸癌的治療和預后有著重要意義。

Plexin A1是表達在神經(jīng)細胞表面的一個鈣依賴的細胞黏附分子，是Semaphorins家族的受體。Plexin A1與細胞骨架重塑相關(guān)，在胚胎時期的大腦中大量表達，具有軸突引導作用，參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育［5］。Plexin A1作為Semaphorin 6D的受體，在上皮細胞遷移和心臟的形態(tài)發(fā)生過程中扮演著關(guān)鍵的角色，Plexin A1能夠調(diào)節(jié)心內(nèi)膜細胞遷移，它的缺失能夠?qū)е滦氖抑旅軐幼儽∽冃∫约靶×盒纬扇笔В?，6］。最近研究發(fā)現(xiàn)，Plexin A1在胃癌、舌癌和惡性胸膜間質(zhì)皮質(zhì)瘤等惡性腫瘤中高表達，并參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程［7～9］。我們的RT-PCR結(jié)果和免疫組化結(jié)果同樣顯示，Plexin A1在直腸癌中高表達，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Dukes分級存在相關(guān)性。

近年來許多研究表明，腫瘤血管生成與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。MVD可以作為反映腫瘤血管生成的一個指標，也有可能成為腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的指標之一［10］。Nakasaki［11］發(fā)現(xiàn)，MVD 與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，Plexin A1的表達與MVD呈正相關(guān)，Plexin A1高表達的結(jié)腸癌組織中MVD顯著增加（P＜0.05）。Plexin Al可能通過調(diào)節(jié)直腸癌的血管生成參與直腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

本研究首次報道Plexin Al在直腸癌中高表達，并且與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移和血管生成密切相關(guān)。檢測Plexin A1的表達能預測直腸癌的轉(zhuǎn)移，為直腸癌的發(fā)生發(fā)展機制提供新的研究方向。Plexin Al能否作為判定直腸癌預后因素需進一步隨訪研究。

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