柏慧，嚴光

(安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院老年醫(yī)學科，合肥230001)

阿爾茲海默病(AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床以記憶和其他認知功能的漸進性喪失為主要特征，病理上主要表現(xiàn)為相關皮質下的老年斑積聚(SPs)和神經(jīng)元纖維纏結(NFTs)［1-2］。AD嚴重影響人們身心健康，可導致持續(xù)性進行性癡呆，但目前還無有效治療措施。其患者總數(shù)逐年增加，預計到2020年將超過現(xiàn)在的2倍，這個特殊病人群體的治療費用也因為治療措施的昂貴而不成比例的增加。因此，充分理解AD發(fā)病機制對提高預防治療水平是非常迫切的。人們已對AD的各種發(fā)病機制展開了深入的研究，本綜述將對阿爾茲海默病中G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRKs)功能紊亂的研究進展做一簡要總結。

1 GRKs

1.1 GRKs家族 GRKs首次發(fā)現(xiàn)于受體脫敏過程中，屬絲氨酸/蘇氨酸激酶家族。依據(jù)序列同源性可將GRKs分為三組:視紫紅質激酶亞家族(GRK1和GRK7)，β腎上腺素受體激酶亞家族(GRK2和GRK3)，GRK4亞家族(GRK4、GRK5 和 GRK6)。這些激酶既有共性也有特性，GRK2、3、5和6廣泛存在于哺乳動物的組織中，而GRK1、4和7只存在于個別器官中。其中GRK1和7表達于視網(wǎng)膜桿狀和錐狀細胞，GRK4存在于睪丸、小腦和腎臟［3］。

1.2 GRKs的功能 GRKs在結構上包含一個中心位于第263-266的氨基酸催化區(qū)，側面是大的氨基和羧基末端調節(jié)區(qū)。GRKs的氨基末端調節(jié)區(qū)的共同區(qū)域論證了結構的同源性。這些結果暗示了氨基末端調節(jié)區(qū)可能會執(zhí)行所有GRKs的一個共同功能，這個功能很可能是受體識別。GRKs的主要功能是使活化的G蛋白偶聯(lián)受體(GRCPs)脫敏化，這個負性調節(jié)過程包括磷酸化活化的受體，解偶聯(lián)G蛋白受體，啟動受體內在化。GRKs磷酸化激活狀態(tài)下的 GPCRs，受體磷酸化后與抑制蛋白(arrestins)結合，致受體與G蛋白脫偶聯(lián)，引起受體脫敏。受體與arrestins結合后，參與網(wǎng)格蛋白介導的細胞內吞作用，依據(jù)傳統(tǒng)觀點這種內吞作用再次激活受體，并將其運回質膜重新利用［4-5］。因此，位于G蛋白-受體界面的GRKs的主要功能就是使激活狀態(tài)的GRCPs發(fā)生脫敏。

1.3 GRKs的共性和特性 GRKs的體外研究認為GRKs的共性可能就是GRKs的七種亞型可以磷酸化不同的GRCPs可能不存在差異性［4］。隨著GRK的轉基因和基因敲除小鼠的產(chǎn)生，體內試驗明確證實了 GRKs的功能特性。例如，缺乏 GRK2，3，5，6的老鼠分別展現(xiàn)出對腎上腺素、毒蕈堿、多巴胺受體脫敏的選擇性損傷［6-9］。隱藏在體內這種功能特異性之下的分子機制仍有待闡明。

1.4 GRKs的亞細胞分布 體外實驗已證實GRK2和GRK5可以磷酸化突觸核蛋白［10］。另有研究報道GRK的獨立功能，如GRK5可以抑制核因子NF-κB的活動［11-12］。盡管如此細胞膜上的GRCP仍然是GRKs的主要底物，這一特性決定了GRKs在細胞膜上執(zhí)行主要功能。GRK4亞家族成員主要位于靜息細胞的質膜上，與磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)、磷酸絲氨酸(PS)結合，可以磷酸化被激動劑激活的GRCPs［4］。其他 GRK 亞科主要位于細胞質中，當GRCPs被激活后，才易位到胞膜上執(zhí)行功能。因此，凡是可以改變這些調節(jié)因子細胞濃度的因素可能會改變GRKs的亞細胞位置及活性。

2 GRKs功能紊亂和AD的聯(lián)系

細胞水平的健康依賴于細胞信號傳導系統(tǒng)的動態(tài)平衡。AD的病理學特征之一是神經(jīng)信號傳導系統(tǒng)失衡。主要表現(xiàn)為:(1)某些蛋白激酶的活動增強以及某些蛋白磷酸酶酯的活動減弱導致神經(jīng)纖維變性［13］;(2)β-淀粉樣蛋白(Aβ)的水解增加以及清除減少導致大腦淀粉樣變［14］;(3)神經(jīng)小膠質細胞和星形膠質細胞的過度激活導致神經(jīng)元炎癥性損傷［15］。已有研究發(fā)現(xiàn)AD的信號傳導系統(tǒng)以過度活躍為特征［16］，尤其歸因于眾多GPCRs及其下游信號［17］。更具體的說，一些研究者指出信號傳導缺失的部位在GRKs主要活動的受體-G蛋白界面［18］。

2004年，Suo等［19］最早就 GRKs功能紊亂與AD關系做了研究。他們調查了低劑量可溶性Aβ預處理的細胞如小膠質細胞、神經(jīng)元等對一些GRCP刺激物如凝血酶等非常敏感的原因。結果發(fā)現(xiàn)做過Aβ預處理后，胞膜上的GRK5迅速轉移至胞質，而胞質里的GRK2沒有被轉移至胞膜，使得GRK的活性受抑制，凝血酶信號通路中的GRCP受體不能及時脫敏，最終導致預處理后的細胞極度活躍。目前對Aβ改變GRK亞細胞位置的機制還不是很清楚。但不難想象的是，Aβ對細胞內鈣離子濃度和胞膜磷脂的影響在其中起到了非常重要的作用。他們在體外實驗中同樣發(fā)現(xiàn)TgCRND8轉基因小鼠胞膜上GRK2和GRK5含量減少，而胞質中GRK2和GRK5含量增加。所有這些改變從AD前驅期開始一直持續(xù)到晚期階段。之后在AD患者尸體的大腦中證實了GRK亞細胞位置的晚期改變［20］。

2.1 GRK2功能紊亂與AD 早期已有實驗詳細描述了AD轉基因小鼠大腦中GRK2的變化［19］。它包括兩方面:胞膜上GRK2濃度的中度下降和胞質中GRK2濃度的顯著提高。之后的研究又證實了AD患者大腦樣本中GRK2過度表達，且沉積在損傷的線粒體和NFTs［21-22］。有趣的是，AD患者外周血樣本中的GRK2總體水平不僅高于對照組，且與認知水平負相關［23］。在 GRK2缺失小鼠模型中，GRK2缺失后通過影響β腎上腺素受體脫敏，造成不可補償?shù)娜毕?，而這一結果僅限于心血管系統(tǒng)［6］。也就是說，由AD患者胞膜上GRK2濃度的適度下降引起的一些病理改變可能僅限于心血管系統(tǒng)。由于GRK2在組織中廣泛存在和表達，對由GRK2總濃度升高產(chǎn)生的潛在影響，可能不只在腦血管方面，還包括線粒體損傷和NFTs。但事實上，在GRK2轉基因小鼠中GRK2只在心血管系統(tǒng)中過度表達［24］，這也為確認GRK2在心血管系統(tǒng)中的作用提供了依據(jù)。

這些體內體外研究結果提示GRK2的過度表達是一個早期事件，發(fā)生在AD的前驅階段，這一階段的損傷是可逆的。到目前為止，相關研究還停留在GRK2功能紊亂和AD關聯(lián)性的研究上。AD患者同時存在神經(jīng)損傷和血管并發(fā)癥，這一發(fā)病機制是否與GRK2功能紊亂有關?對此的認識還限于對心腦關聯(lián)的理解上［25］。

2.2 GRK5功能紊亂與AD AD轉基因小鼠的GRK5變化同樣包括胞膜上GRK5濃度的下降和胞質中 GRK5濃度的上升，但總體水平改變不明顯［19］。同GRK2轉基因小鼠相似，GRK5轉基因小鼠的基因也加有心臟特殊啟動子，不適合用于研究非心血管組織中GRK5過度表達的影響。然而，體外研究的最新成果報道GRK5的RH區(qū)通過激酶依賴的機制抑制了核因子NF-κB，導致了腫瘤細胞的凋亡［11-12］。如果這種影響在體內實驗也存在，那么胞漿中GRK5濃度的提高同樣可以促使神經(jīng)細胞的退化。

2.2.1 胞膜上GRK5的缺失在AD發(fā)病機制中的作用 為了執(zhí)行在GRCP脫敏中的主要功能，GRKs要么如GRK5預先位于胞膜上，要么添補到胞膜上。特別在發(fā)現(xiàn)GRK5某些與激酶無關的功能之前，使GRCP脫敏被認為是GRK5的全部功能。GRK5缺失特指GRK5在胞膜上和功能上的缺失，而不是全體GRK5的下調。

2.2.2 導致GRK5缺失的因素 GRK5的亞細胞位置由促胞膜結合因素和促胞質結合因素之間的平衡來調節(jié)。與AD或衰老相關的因素打破這一調節(jié)平衡導致胞膜GRK5缺乏。低劑量的可溶性Aβ就是其中因素之一［19］，它與 AD關系密切。除此之外，谷氨酸、高同型半胱氨酸以及氧化應激都可以引起胞膜GRK5缺失。事實上雖然總體GRK5隨著年齡的增長是上調的，但與年輕小鼠相比，衰老小鼠的胞膜GRK5仍顯著缺乏。通過這些初步觀察結果可以推測:胞膜GRK5缺乏可能與正常衰老中的基因變異有關，而在AD中GRK5缺失則更為嚴重。

2.2.3 GRK5缺乏在病理上的影響 關于這方面的證據(jù)主要是從GRK5缺乏的小鼠模型如GRK5KO小鼠和GRK5KO/APPsw小鼠中得到的?？梢灶A料的是，GRK5KO小鼠可以產(chǎn)生一種編碼第1-178氨基酸的轉錄物，這種轉錄物覆蓋了RH區(qū)的第50-176氨基酸［8］。這就意味著GRK5KO小鼠只是在GRK5中缺乏依賴激酶活性的功能形式，依賴于GRK5的RH區(qū)或不依賴于激酶的區(qū)域卻沒有改變。另外，與其他AD小鼠模型相比，基因修改還沒有發(fā)生在與AD相關的基因如β-淀粉狀蛋白前體蛋白(βAPP)、早老蛋白、tau蛋白、載脂蛋白E等。因此，這些小鼠的表型僅僅由GRK5活性的喪失或缺乏導致的。

給予非選擇性毒蕈堿激動劑的年輕大鼠展現(xiàn)出輕度自發(fā)性低體溫和顯著的行為超敏［8］，老年對照組則展示了明顯的短時程工作記憶短缺和低敏感性［26］。遺忘型輕度認知障礙或多或少參與病理改變水平的調節(jié)，這種病理改變包括軸突缺陷，突觸蛋白及毒蕈堿受體下降，海馬可溶性Aβ和tau蛋白水平上升。突觸素水平是突觸退化的權威性標志物，但在雌雄混合老鼠中并未顯著改變，但之后只在GRK5KO雌鼠中發(fā)現(xiàn)突觸素水平明顯下降［27］。除了在電子顯微鏡中觀察到的微量類似Aβ的纖維狀結構和被活性星形膠質包裹的退化軸突成分，沒有發(fā)現(xiàn)任何SPs或炎性反應的改變。分級辨別函數(shù)分析得出不同基因型組別之間的區(qū)別很明顯，這支持了GRK5存在顯著的基因劑量效應。因此，單獨GRK5缺乏可以導致遺忘型輕度認知障礙的發(fā)生，加速了衰老過程中與AD相關的病理進程。

GRK5缺乏最初被發(fā)現(xiàn)選擇性損傷毒蕈堿受體脫敏［8］，近期有研究證實了這一發(fā)現(xiàn)并一步論述了這種選擇性主要針對毒蕈堿受體中全部M2、部分M4，但不包括 M1［28］。眾所周知，M1、M2、M4 在海馬中含量豐富。M2/M4作為主要的突觸前受體，負性調節(jié)著海馬記憶回路中乙酰膽堿的釋放［29］。GRK5缺乏在病理方面的潛在影響可能是雙重的:(1)它直接引起突觸前M2/M4自身受體信號的延長或者突觸前膽堿能過度活躍;(2)突出前膽堿能過度活躍反過來導致海馬記憶回路中ACh釋放減少，使得包括突觸后M1在內的突觸后膽堿能活動減退。對于這一點，已有研究證實了GRK5缺乏導致了 ACh 釋放減少［28］。

對GRK5缺陷的APPsw老年小鼠的最初研究發(fā)現(xiàn):相對于APPsw小鼠，GRK5KO缺陷的APPsw小鼠的大腦發(fā)生了非常嚴重的炎性反應，包括微球蛋白和星形膠質蛋白的形成［30］。GRK5KO小鼠大腦中未發(fā)現(xiàn)任何炎癥性反應，但與APPsw小鼠雜交后，卻表現(xiàn)出比 APPsw小鼠更為嚴重的炎癥性反應。這種嚴重的炎癥性反應是GRK5缺陷和APPsw過度表達協(xié)同作用的結果。另外有研究還發(fā)現(xiàn)在GRK5KO老鼠中可溶性 Aβ濃度有了中度的增長［26］。GRK5缺失可能會促進GRK5缺陷的APPsw小鼠的Aβ積聚，最終導致更嚴重的炎癥性反應。

2.2.4 GRK5缺乏和現(xiàn)存AD發(fā)病機制假說的關系

關于AD的致病因素和發(fā)病過程的討論由來已久，在眾多假設當中，膽堿能損傷假說和Aβ毒性假說是其中廣為接受的兩種，它們極大促進了AD藥物學研究的發(fā)展［31］。前者認為，中樞膽堿能神經(jīng)功能障礙在很大程度上是AD認知功能下降的主要原因;后者則提出AD的中樞致病分子是Aβ。隨著對AD發(fā)病機制的逐漸深入了解，關于假說細節(jié)的描述得到不斷完善，這使得這些假說的地位更加牢固［31-34］。關于GRK5缺失的研究可能會成為兩種假說聯(lián)系的橋梁。一方面，Aβ是GRK5缺乏的主要誘導因素之一;另一方面，GRK5的缺乏選擇性地使膽堿能功能受到損傷。已有研究［35-36］顯示膽堿能異常，特別是突觸后膽堿能活動減退，通過β淀粉生成途徑影響APP過程，最終促進了Aβ生成。這些過程形成一個惡性循環(huán)，導致Aβ的積聚和膽堿能異常，加速了AD的病理進程。

3 結論與展望

GRKs功能紊亂不僅與AD大部分病理過程具有緊密的相關性，并且是導致Aβ積聚與膽堿能功能障礙之間惡性循環(huán)的主因之一。展望GRKs理論的未來，由于上述原因的存在，使得其具備成為一個理想的AD等神經(jīng)退行性疾病的有效預防和治療靶點的強大可能性。

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