劉 軻 馮靜靜 劉敬霞 李建生 (河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

缺血性腦血管病是病理過程涉及復雜的時間和空間級聯(lián)反應，致殘率和致死率均較高。目前，臨床治療主要是通過超早期溶栓和腦神經(jīng)保護等措施來挽救缺血半暗帶的神經(jīng)元和促進損傷后神經(jīng)功能的恢復，雖然部分患者神經(jīng)功能恢復較好，但仍有50% ～70%的存活者遺留癱瘓、失語等嚴重殘疾〔1，2〕。目前研究最多的是骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)為缺血性腦病的治療提供了新途徑，現(xiàn)就BMSCs動員治療缺血性腦病的實驗研究進展進行綜述。

1 BMSCs的生物學特點

1.1 定義 Minguell等〔3〕將BMSCs概括為:存在于骨髓基質(zhì)內(nèi)的非造血細胞來源的細胞亞群，它們可以在體外擴增，在體外經(jīng)誘導后最終分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌腱細胞、肌管、神經(jīng)細胞與支持造血干細胞的基質(zhì)。同所有的干細胞一樣，骨髓也具有自我更新能力和多向分化潛能。它雖然僅占骨髓單核細胞的0.001% ～0.01%，且隨著年齡的增加而減少，但是卻具有驚人的增值能力。

1.2 BMSCs的體外分離、培養(yǎng)及分化 BMSCs是存在于骨髓中的一種非造血干細胞，可通過不同方法進行體外分離及培養(yǎng)，具有高度的增殖能力，易純化，均一性好;體外培養(yǎng)時呈成纖維樣集落形成單位，并貼壁生長。閆西剛等〔4〕發(fā)現(xiàn)BMSCs在體外分離、培養(yǎng)的條件下生長良好，經(jīng)誘導后可大量分化為神經(jīng)元樣細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。杜振宗等〔5〕收集成人骨髓血，利用建立體外分離培養(yǎng)、純化BMSCs的方法，觀察BMSCs的增殖及生長特性。發(fā)現(xiàn)利用貼壁方法獲取的BMSCs具有較強的增殖的能力，純度高，可以作為組織工程的種子細胞，為組織工程血管的構建提供依據(jù)。徐龍強等〔6〕實驗研究也發(fā)現(xiàn)在體外特定環(huán)境下誘導原代BMSCs向神經(jīng)干細胞轉(zhuǎn)化，并向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞分化?？梢夿MSCs作為一種較為理想的種子細胞，為治療神經(jīng)元性疾病提供了一個極為豐富的供體細胞資源平臺。

2 BMSCs的可塑性研究

BMSCs具有的跨系譜、跨胚層分化的潛能稱為BMSCs的可塑性。也稱之為轉(zhuǎn)分化或橫向分化。過去認為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)屬不可再生組織，但近年來研究表明成體哺乳動物齒狀回、嗅球和脊髓都存在神經(jīng)發(fā)生，在體內(nèi)外能化為包括神經(jīng)細胞、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞在內(nèi)的神經(jīng)細胞〔7〕。姚曉黎等〔8〕報道了多項實驗研究認為BMSCs在一定的誘導條件下，可在體外體內(nèi)分化成為神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞等。而BMSCs的可塑性研究不僅是BMSCs能跨胚層分化為外胚層的神經(jīng)組織細胞，同時也有研究表明BMSCs移植后對腦缺血后梗死灶周圍神經(jīng)細胞可塑性及突觸在生的影響。為BMSCs動員療法治療缺血性腦病提供了理論依據(jù)。張小喬等〔9〕利用 SD大鼠制作腦缺血模型，并將實驗大鼠隨機分為假手術組、模型組、磷酸鹽緩沖液(PBS)組和BMSCs組，分別通過測定梗死灶周圍腦組織突觸素(SYN，是突觸重建和突觸可塑性的重要標志)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF，一種重要的調(diào)節(jié)修飾已有的突觸結構和誘導新的突觸聯(lián)系形成的神經(jīng)營養(yǎng)因子)mRNA的表達來研究腦缺血24 h后移植BMSCs的大鼠神經(jīng)缺損評分(NSS)，發(fā)現(xiàn)與模型組及PBS組大鼠相比，BMSCs組的NSS評分較低，但SYN和BDNF mRNA的表達則明顯較高，結果證實經(jīng)靜脈移植BMSCs能促進腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復，并在突觸可塑性及突觸再生中發(fā)揮作用，而突觸的再生及神經(jīng)的可塑性是腦缺血后神經(jīng)功能長期修復的重要組成部分。

3 BMSCs動員和歸巢

3.1 動員 骨髓釋放其干細胞到外周血的現(xiàn)象稱為BMSCs動員。其動員的途徑主要包括動員劑的應用、原位增殖及動員后移植。廣義上講，BMSCs動員指通過機體本身的代償機制以及外界人為因素干預，促使BMSCs遷移到骨髓外，以增加循環(huán)血液中干細胞數(shù)量。狹義上，則主要指通過使用動員劑等藥物進行干預促使BMSCs釋放到外周血。目前所使用的動員劑主要有粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、基質(zhì)細胞衍生因子(SDF-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、干細胞因子(SCF)、白細胞介素(IL)-3、IL-12、IL-27和化療藥物，如環(huán)磷酰胺(Cy)等，以G-CSF、GM-CSF的應用最為廣泛，G-CSF、GM-CSF在動員造血干細胞的同時，對EPC和骨髓基質(zhì)細胞也有動員作用。G-CSF還可引起外周血中黏附分子升高，以影響干細胞對骨髓基質(zhì)和EPC的黏附作用〔10〕。這一過程同時涉及一系列細胞黏附分子和趨化因子、生長因子等的相互調(diào)節(jié)反應，影響干細胞的黏附、遷移和定居特性，使干細胞穿過基質(zhì)膜和血管內(nèi)皮層進入循環(huán)血流中，致外周血中的干細胞數(shù)增加。

3.2 歸巢 BMSCs的歸巢特性是指它們能自動向損傷及炎癥區(qū)域的定向遷移。進而動員的BMSCs才可能完成對缺血損傷部位的修復。BMSCs能夠表達多種細胞因子及趨化因子，而許多研究表明，缺血性腦病患者存在局部和全身的炎癥反應，在患者的血液中炎癥分子包括細胞因子(TNF-α、IL-1B、IL-8、IL-18)和可溶性黏附因子〔L-selectin、E-selectin、P-selectin、可溶性黏附因子(ICAM)、血管細胞間黏附因子(VCAM)〕升高〔11〕。這意味著BMSCs有向缺血損傷區(qū)組織局部趨化的能力。有研究認為，移植含有血管內(nèi)皮細胞(EPC)的混合細胞成分(這些細胞多可以合成釋放多種促進BMSCs遷移、分化和血管新生的因子，如 VEGF、SCF、G-CSF、SDF-1等)，更有利于促使中風后缺血邊界區(qū)的血管生成，改善缺血組織的血液循環(huán)，緩解缺血狀態(tài)〔12〕。

4 BMSCs動員治療缺血性腦損傷的可能機制

4.1 BMSCs自身分化為神經(jīng)元樣細胞和神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞BMSCs具有多潛能干細胞的特性，在特定條件下可以打破胚層起源的限制向外胚層神經(jīng)元細胞和內(nèi)胚層肝卵圓細胞分化，發(fā)展為成熟神經(jīng)細胞，替代損傷細胞，重建神經(jīng)環(huán)路，從而達到恢復神經(jīng)功能的目的〔13〕。郭聞師等〔14〕實驗研究證實大鼠的BMSCs體外多次傳代后，經(jīng)全反式維甲酸(ATRA)和神經(jīng)生長因子(NGF)誘導后可分化為神經(jīng)細胞元樣細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。同時實驗研究結果顯示單味中藥如仙茅水提物誘導后的BMSCs有神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)和肢質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)表達，促進BMSCs向神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的分化和轉(zhuǎn)化化。作用機制可能為:①增強細胞Na-K-ATP酶的活性，直接增加細胞代謝，促進細胞分裂，②增加某些細胞受體開關的啟動，而這些受體的啟動促使其向神經(jīng)元細胞分化〔15〕。

4.2 刺激內(nèi)源性神經(jīng)干細胞和神經(jīng)祖細胞的增殖分化 在正常情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在尚未激活的神經(jīng)元。腦缺血后，BMSCs進入體內(nèi)后，可能通過某種機制激活了這些神經(jīng)干細胞，從而再生為神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，促進了神經(jīng)功能的恢復;郭亮等〔16〕將BMSCs注入大腦中動脈栓塞后的大鼠體內(nèi)并在移植前的48 h在細胞培養(yǎng)液中加入10 μmol/L BrdU進行標記，28 d后在熒光顯微鏡下可見腦梗死灶(海馬)邊緣聚集大量BrdU陽性細胞，而健側腦組織中BrdU陽性細胞數(shù)量相對較少。腦梗死灶邊緣可見少量BrdU陽性細胞表達神經(jīng)元特異性烯醇化酶。說明BMSCs可促進局灶性腦缺血大鼠內(nèi)源性神經(jīng)前體細胞的增殖、遷移，從而對腦缺血再灌注損傷起保護作用。

4.3 應用G-CSF動員促進神經(jīng)功能的恢復 目前已經(jīng)證實G-CSF是BMSCs強有力的動員劑，當腦缺血損傷時，G-CSF可動員大量BMSCs向損傷部位遷移，在特定的病理環(huán)境下分化為神經(jīng)細胞，以修復損傷的神經(jīng)組織〔17〕。其作用機制研究進展可能為以下幾個方面。

4.3.1 抑制腦缺血損傷神經(jīng)細胞凋亡 研究證明，大鼠大腦中動脈閉塞后再灌注的神經(jīng)細胞凋亡是伴隨著壞死發(fā)生的，而BMSCs能夠刺激內(nèi)源性神經(jīng)細胞再生，抑制細胞凋亡，從而減少缺血再灌注損傷細胞凋亡的發(fā)生，明顯改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能〔18〕。黃月等〔19〕研究證明，向腦缺血再灌注后大鼠注入BMSCs能上調(diào)Bcl-2蛋白表達，下調(diào)Bax蛋白表達，減少神經(jīng)細胞凋亡，改善腦損傷大鼠的神經(jīng)功能。劉雪平等〔20〕觀察應用G-GSF動員自體BMSCs對大鼠腦缺血后神經(jīng)凋亡的影響。他們將SD大鼠隨機入選的72只分為模型動員組、模型非動員組和假手術組;用線栓法制備大鼠局灶性大腦中動脈栓塞/再灌注模型，并以CD34和Brdu免疫組化染色觀察比較大鼠腦缺血/再灌注后的新生血管生成情況，模型動員組大鼠腦組織缺血再灌注后48，72 h缺血區(qū)邊緣可見新生毛細血管生成且逐漸增多，72 h至1 w后可見大量新的毛細血管，與模型非動員組比較，48 h后細胞凋亡改善明顯;而模型未動員組僅有少量新生毛細血管;48 h后缺血區(qū)新生毛細血管密度也較低。結果表明，BMSCs經(jīng)G-CSF動員后可向大鼠腦缺血區(qū)趨化并可分化為神經(jīng)元前體細胞，顯著促進腦缺血區(qū)血管再生，降低腦神經(jīng)功能評分，降低細胞凋亡率。李建生等〔21，22〕實驗研究結果也顯示，應用G-GSF動員BMSCs并聯(lián)合中藥腦脈通(由大黃、人參、川芎、葛根組成)可以抑制腦缺血損傷引起的神經(jīng)細胞凋亡，影響相關凋亡蛋白 Fas、Fasl、caspase-3及 Bax、Bal-2的表達，其作用機制可能為在腦缺血早期下調(diào)了的促凋亡基因Fas、Fasl及Bax的表達，后期上調(diào)了抑凋亡基因Bal-2的表達，進而阻抑caspase-3引起的凋亡瀑布反應，從而發(fā)揮對腦缺血神經(jīng)細胞凋亡的阻抑作用。

4.3.2 促進腦缺血損傷后血管新生 張子強等〔23〕研究表明應用G-CSF動員自體骨髓干細胞，能夠促進大鼠腦組織缺血區(qū)的血管新生，改善缺血局部血流灌注并促進其腦功能的恢復，其機制應該是部分動員的EPC“歸巢”到腦缺血區(qū)并分化形成新生血管。

4.3.3 促進缺血性損傷后神經(jīng)功能的恢復 腦缺血后造成大量神經(jīng)元細胞缺失導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的功能難以恢復。目前的藥物治療作用有限。近年來隨著干細胞研究的深入，發(fā)現(xiàn)BMSCs是一組具有多向分化潛能和自我更新能力的細胞群，在生長和修復過程中起重要作用。葛朝莉等〔24〕實驗研究發(fā)現(xiàn)G-CSF作為BMSCs強有力的動員劑，可以大大提高外周血的干細胞數(shù)量。說明G/CSF能夠改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能。而多項實驗研究結果也證實在缺血性腦梗死的急性期給予實驗大鼠腹腔內(nèi)注射G-CSF，循環(huán)中被動員的干細胞數(shù)量會明顯增加，因而在缺血腦組織局部炎癥反應的“呼喚作用”下，歸巢的干細胞數(shù)量增多，而歸巢干細胞的絕對數(shù)量決定了大鼠梗死腦容積減小、缺血區(qū)新生血管再生，進而改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能〔25，26〕。

5 問題與展望

盡管近年來有關人BMSCs的分離、培養(yǎng)和神經(jīng)分化潛能及腦缺血性疾病應用方面的研究很多，并取得了較大的進展，但仍存在一些問題有待解決。如BMSCs培養(yǎng)的標準化及干細胞身份的確定是相關研究的前提，并且現(xiàn)在仍有尚未被證實的骨髓干細胞表面標志，因此在BMSCs的鑒定上存在困難。而關于BMSCs的具體治療機制仍未明了，BMSCs能否分化為具有完全功能的宿主神經(jīng)細胞并與宿主細胞建立正常聯(lián)系，重建缺血損傷的神經(jīng)功能;在促進內(nèi)源性干細胞增殖等方面是否具有更為積極的修復作用尚不得而知;與BMSC s研究的整體水平相比，中醫(yī)藥對BMSCs作用的研究尚處于探索階段，相關的文獻報道較少?？傊?，BMSCs動員在治療缺血性腦損傷方面具有廣闊的發(fā)展前景。BMSCs向神經(jīng)細胞方向分化的潛力及移植后對實驗動物缺血性腦損傷的功能改善作用為人類的神經(jīng)系統(tǒng)疾病尤其是腦缺血性疾病的治療提供了一條新的途徑。

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