杜曉巖 劉春秀 滿大鵬 徐品一

(佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院整形美容外科，佳木斯154000)

100多年以前，Coley首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌制品能夠治療非細(xì)菌感染性疾病?，F(xiàn)在已經(jīng)明確細(xì)菌DNA和合成的CpG ODN(CpG Oligodeoxynucleotide)是強效的免疫激動劑。CpG ODN具有高效低毒、性質(zhì)穩(wěn)定、易于合成等優(yōu)點，目前已應(yīng)用于哮喘和其它變態(tài)反應(yīng)性疾病、感染性疾病和腫瘤等的研究中并取得顯著療效，初步應(yīng)用于臨床研究。

1 CpG ODN的發(fā)展史

在十八世紀(jì)九十年代，紐約外科醫(yī)生Coley［1］用細(xì)菌使腫瘤發(fā)生退行性變，當(dāng)時人們把此療效歸因于內(nèi)毒素，約100年后，才有人證明細(xì)菌DNA自身能夠激活免疫系統(tǒng)［2］，通過對合成ODN的研究人們得知，這種免疫刺激作用是因為它含有具有特異性側(cè)翼序列的非甲基化CpG基序［3］。2000年，Hemmi等［4］發(fā)現(xiàn)CpG ODN的免疫刺激作用是由TLR9介導(dǎo)的，學(xué)者們將這一類富含CpG基序的ODN稱為CpG ODN［5］。

2 CpG ODN的分類

根據(jù)磷酸骨架、CpG二核苷酸的位置和數(shù)量、回文序列和它們對人外周血單核細(xì)胞的作用，CpG ODN被分成 A、B、C三類，三類 CpG ODN都能與TLR9作用，但它們活化的細(xì)胞類型和免疫刺激作用有很大差異。其中，B類CpG ODN是臨床應(yīng)用的研究熱點［6］。還有文獻提及由硫代磷酸骨架組成兩個回文結(jié)構(gòu)的P類CpG ODN，已用于體外實驗調(diào)控固有免疫應(yīng)答［7］。目前，很多學(xué)者正致力于新型CpG ODN的研發(fā)和臨床前期實驗，優(yōu)化CpG ODN的性質(zhì)和療效。

3 CpG ODN的作用機制

CpG ODN通過細(xì)胞內(nèi)化以小泡的形式進入細(xì)胞，小泡與內(nèi)體融合，導(dǎo)致CpG ODN進入酸性的內(nèi)體環(huán)境。CpG ODN與內(nèi)膜上的TLR9相互作用，完成識別，隨著內(nèi)體成熟，CpG ODN被酸化，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的氧化壓力，導(dǎo)致經(jīng)典的TLRS信號級聯(lián):MyD88(髓樣分化因子88)-IRAK(IL-1受體相關(guān)激酶 )-TRAF6(TNF受體相關(guān)因子 6)，最終激活NF-κB和MAP激酶等轉(zhuǎn)錄因子，激活免疫細(xì)胞，包括樹突狀細(xì)胞(DCs)，單核巨噬細(xì)胞及B細(xì)胞;誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞的遷移;上調(diào)主要組織相容性復(fù)合物MHCⅡ類分子、CD40、CD80/B7-1、CD86/B7-2 等共刺激分子的表達。間接激活抗原特異性T細(xì)胞和NK細(xì)胞，激發(fā)獲得性免疫應(yīng)答?；罨疍Cs、單核巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子(TNF)-ɑ、干擾素(IFN)-γ和白介素(IL)-6、IL-12等炎性因子，誘發(fā)Th(T輔助)1型炎癥反應(yīng);活化的B細(xì)胞分泌IL-6，免疫球蛋白(Ig)G及IgM等。這樣，CpG ODN與TLR9相互作用，有效地架起固有免疫和獲得性免疫之間的橋梁［8］。

4 CpG ODN的安全性

CpG ODN已成功應(yīng)用于動物模型，全身給藥及局部注射等都不會形成膿腫。目前的動物實驗中，CpG ODN的用量并沒有導(dǎo)致任何顯著的并發(fā)癥，但由于TLR9活化作用誘導(dǎo)產(chǎn)生的IFN-ɑ，抗CpG ODN IgM抗體的產(chǎn)生，TNF-ɑ等細(xì)胞因子產(chǎn)物的積累，大劑量長期使用CpG ODN或?qū)⑵渑c一些試劑(如脂多糖)等共同使用也會產(chǎn)生嚴(yán)重的并發(fā)癥。在人類臨床試驗中，已有學(xué)者研究了 TLR9激動劑在0.002 5 mg/kg到 0.81 mg/kg范圍內(nèi)的安全性，但人類對于CpG ODN的最小耐受劑量還未確定，主要的并發(fā)癥是劑量相關(guān)的局部注射反應(yīng)(如疼痛、腫脹等)或全身流感樣反應(yīng)(如頭痛、發(fā)熱等)。根據(jù)劑量不同，全身性反應(yīng)一般在12小時到24小時內(nèi)出現(xiàn)，持續(xù)1～2天或更長，但不加TLR9激動劑，疫苗也會引起局部注射反應(yīng)。以CpG ODN為佐劑的疫苗進行頻繁注射時，局部反應(yīng)較單獨應(yīng)用疫苗的反應(yīng)稍稍增加，但一般都較輕微，在腫瘤學(xué)應(yīng)用中CpG ODN大劑量局部注射可產(chǎn)生嚴(yán)重的注射局部反應(yīng)，顱內(nèi)應(yīng)用還可引發(fā)癲癇，目前還不清楚是CpGODN引起的還是操作不當(dāng)引起的［9］，因此，在CpG ODN用于大量患者之前還必須進行更加深入的研究。

5 CpG ODN的應(yīng)用

5.1 哮喘及變態(tài)反應(yīng)性疾病 變態(tài)反應(yīng)性疾病的許多臨床表現(xiàn)源自Th2型免疫應(yīng)答。CpG ODN能夠作用于漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDCs)、誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-10、使Treg(T調(diào)節(jié))細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β等抑制Th2細(xì)胞活化。CpG ODN對于治療哮喘、過敏性結(jié)膜炎、過敏性鼻炎都有一定的療效?？茖W(xué)家們將一種病毒樣粒子處理的A類CpG ODN與屋塵螨提取物結(jié)合用于21名患者的免疫治療，療效顯著:在治療后至少38周內(nèi)，結(jié)膜激發(fā)試驗顯示過敏性反應(yīng)幾乎完全根除，過敏性哮喘和鼻炎癥狀明顯減輕［10］。有研究稱CpG ODN可顯著抑制哮喘模型的氣道炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡、調(diào)控TLR9表達［11］。CpG ODN滴眼對實驗性變態(tài)反應(yīng)性結(jié)膜炎具有顯著的治療作用［12］。一種B類CpG ODN與部分豚草屬抗原共軛對鼠的免疫治療療效顯著，將其作為過敏性鼻炎的疫苗用于人類評估它的作用，在Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗中，特異性的使Th2型免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)向一種非過敏性和非炎癥性Th1型免疫應(yīng)答［13］，遺憾的是在第Ⅲ期臨床試驗中并沒有出現(xiàn)以上療效，其原因尚未明確，仍需進一步探究。

5.2 感染性疾病 CpG ODN能夠活化NK細(xì)胞和單核細(xì)胞，引起Th1型免疫應(yīng)答加強固有免疫，所以它可以單獨應(yīng)用或在預(yù)防接種中作為免疫佐劑而作用于感染性疾病。除了加強固有免疫之外，CpG ODN還能加強抗原特異性免疫，被用于治療多種寄生蟲病以及細(xì)菌及病毒感染性疾病。

5.2.1 寄生蟲病 很多學(xué)者把CpG ODN單獨或作為寄生蟲抗原的免疫佐劑用以誘發(fā)保護性反應(yīng):加入CpG ODN和KMP-1112-31aa肽的BM-DCs有效降低利什曼原蟲在內(nèi)臟器官的負(fù)荷［14］;CpG ODN能夠促進未感染過瘧疾的人獲得瘧原蟲特異性記憶B細(xì)胞(MBC)［15］;將 CpG ODN 與 ROP2 和 GRA4 重組蛋白分別應(yīng)用或三者聯(lián)合應(yīng)用進行肌肉注射免疫小鼠，都能使鼠腦弓形蟲蟲量明顯減少［16］。

5.2.2 細(xì)菌感染性疾病 腹腔內(nèi)注射以CpG ODN為佐劑的炭疽吸附疫苗能夠增加A/J小鼠的抗體反應(yīng)速度、大小和活性［17］;CpG ODN能夠促進Th1型免疫應(yīng)答，增強小鼠抵抗結(jié)核分枝桿菌感染的能力，作為卡介苗佐劑皮下免疫BALB/c小鼠能提高卡介苗的免疫效應(yīng)［18］;CpG ODN還可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，如通過直接或間接的固有免疫應(yīng)答增強新型免疫制劑QCDCR治療羅非魚魚型鏈球菌感染的療效［19］。

5.2.3 病毒感染性疾病 CpG ODN可以用于多種病毒感染性疾病。CpG ODN能夠增強機體對乙肝表面抗原的免疫應(yīng)答［20］。用CpG ODN治療丙肝是目前研究熱點，主要的治療方法是結(jié)合聚乙二醇干擾素和利巴韋林，直接加入抗病毒藥物進行持續(xù)治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染的人中約20%能夠自發(fā)的清除病毒［21］。CpG ODN能夠預(yù)防鼠上呼吸道流感感染［22］，最新研究顯示它對禽流感、非典型性肺炎都有顯著的治療作用;CpG ODN還可能防止艾滋病病毒(HIV)-1傳播，預(yù)防和治療頑固性的1型糖尿病、單純皰疹病毒及猴痘病毒等多種病毒感染，可見CpG ODN對多種頑固致命的感染性疾病有較明顯療效，并且在疾病大規(guī)模爆發(fā)的預(yù)防和治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。

5.3 腫瘤 CpG ODN不僅能夠誘導(dǎo)不伴有局部炎癥反應(yīng)的強烈Th1型免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，如TNF、IL-12和 IFN-γ等抵抗腫瘤，還能激活細(xì)胞，如NK細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴(CTL)細(xì)胞、B細(xì)胞等抵抗腫瘤。CpG ODN不僅能單獨使用、作為免疫佐劑使用，還能夠與其它抗腫瘤療法聯(lián)合應(yīng)用。CpG ODN單獨用藥可以對膀胱腫瘤、宮頸癌、胃癌等有抑制作用，給藥途徑有多種，包括腹腔內(nèi)注射、靜脈注射、瘤內(nèi)注射等，研究發(fā)現(xiàn)給藥部位越接近腫瘤治療效果越好［23］。CpG ODN作為佐劑提高免疫治療效果，這種聯(lián)合免疫療法能夠?qū)撬枇?、胸腺瘤、黑色素瘤等有治療作用。此外，將CpG ODN與放療、化療、單克隆抗體等治療方法聯(lián)合應(yīng)用也是目前用于治療腫瘤的研究熱點，它不僅能對放療有增敏作用，優(yōu)化化療患者抗腫瘤的免疫微環(huán)境，還能減輕放療后的輻射損傷和化療后反應(yīng)［24，25］，可能成為減輕患者痛苦，延長患者生命的重要制劑，CpG共軛單克隆抗體 HMFG-2能夠顯著減輕裸鼠胰腺癌腫瘤負(fù)擔(dān)［26］。目前，已有一些CpG ODN進入了臨床試驗階段應(yīng)用于人類身上，CpG ODN(1018 ISS)與利妥昔單抗給患者靜脈注射可能作為對抗非霍奇金淋巴瘤的有效免疫治療方法［27］，CpG 7909的劑量0.01到0.64 mg/kg 2小時靜脈輸注到患者體內(nèi)是安全的，并有免疫調(diào)節(jié)作用。在復(fù)發(fā)性惡性膠質(zhì)瘤的Ⅰ期、Ⅱ期臨床試驗中，CpG ODN延長了志愿者的存活率，耐受性良好［28，29］。此外，CpG ODN 與化療聯(lián)合應(yīng)用于治療非小細(xì)胞性肺癌的第Ⅱ期研究階段顯示其能夠提高患者的存活率［30］，但在第Ⅲ研究中發(fā)現(xiàn)紫杉醇/卡鉑中加入CpG ODN并沒有增強化療藥物的療效而延長患者生命，因此學(xué)者并未進行進一步的研究［31］。

5.4 其他 在對CpG ODN的研究中還發(fā)現(xiàn)它能夠減輕酒精性肝損傷、減弱創(chuàng)傷后出血造成的心臟功能紊亂，促進傷口愈合等［32-34］，在口腔研究領(lǐng)域方面也展示出良好的應(yīng)用前景，它能夠通過調(diào)控IL-8等細(xì)胞因子保護牙齦和牙本質(zhì)健康［35，36］，能夠通過NF-κB途徑調(diào)控成骨破骨相關(guān)因子，如 RANKL、OPG等的表達從而促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化［37］。

6 小結(jié)與展望

綜上所述，CpG ODN不僅能夠靶向活化TLR9，降低哮喘和其他變態(tài)反應(yīng)性疾病的有害炎癥反應(yīng)，還能夠治療多種頑固性感染性疾病，甚至能夠減輕和治愈多種腫瘤，并且在其它領(lǐng)域中也有廣泛的應(yīng)用。目前，CpG ODN的研究仍存在許多不足，如安全劑量、最佳給藥途徑尚未明確、對嚴(yán)重的晚期疾病療效并不顯著等，相信會有更多的學(xué)者致力于CpG ODN的研究，為CpG ODN的臨床應(yīng)用奠定堅實的基礎(chǔ)。

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