褚 春楊 軍王蘇燕丁賽良鄺 孛鄧 彪江振濤

（1 南華大學(xué)附二醫(yī)院藥劑科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2 南華大學(xué)附一醫(yī)院心內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001）

血管成形術(shù)后再狹窄與平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化和遷移及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α表達(dá)上調(diào)有關(guān)

褚 春1楊 軍2王蘇燕2丁賽良2鄺 孛2鄧 彪2江振濤2

（1 南華大學(xué)附二醫(yī)院藥劑科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2 南華大學(xué)附一醫(yī)院心內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001）

目的 為探討血管成形術(shù)后再狹窄形成與平滑肌細(xì)胞（Smooth muscle cells，即SMCs）的遷移和表型轉(zhuǎn)化，以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α（Transforming growth factor-α，即TGFα）在內(nèi)膜增生過(guò)程中的表達(dá)變化的關(guān)系。方法 取40只Sprague-Dawle大鼠行右頸總動(dòng)脈球囊內(nèi)膜剝脫術(shù)建立再狹窄動(dòng)物模型，于第1，3，9，28天和2月取實(shí)驗(yàn)動(dòng)脈段和對(duì)側(cè)正常動(dòng)脈段行光鏡觀察及計(jì)算機(jī)圖像分析，同時(shí)在透射電鏡下觀察SMCs亞微結(jié)構(gòu)變化。并以放免測(cè)定內(nèi)膜增生時(shí)損傷血管組織中TGFα表達(dá)的變化。結(jié)果 圖像分析顯示在球囊損傷第3天即見(jiàn)損傷血管中膜出現(xiàn)明顯增厚，而后恢復(fù)正常厚度。與此同時(shí)球囊損傷第3天內(nèi)膜明顯增厚，而在第9～28天逐漸達(dá)到高峰；在透射電鏡下觀察可見(jiàn)：術(shù)后第3天損傷血管增生內(nèi)膜中近腔面的SMCs就已主要表現(xiàn)為合成表型，在28d和2個(gè)月時(shí)大部分SMCs又恢復(fù)收縮表型的形態(tài)特征。而通過(guò)放免測(cè)定發(fā)現(xiàn)球囊損傷后第3天對(duì)血管組織TGFα表達(dá)明顯增加，與對(duì)側(cè)正常頸總動(dòng)脈標(biāo)本中的TGFα含量有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。結(jié)論 故認(rèn)為大鼠再狹窄模型的內(nèi)膜增生過(guò)程具有明顯的時(shí)相特征，SMCs從中膜向內(nèi)膜的遷移，而SMCs的表型轉(zhuǎn)化在這過(guò)程中顯示出明顯的雙向轉(zhuǎn)化特點(diǎn)，而TGFα在損傷血管的表達(dá)明顯增加，可能參與了內(nèi)膜過(guò)度增生過(guò)程的SMCs的表型轉(zhuǎn)化和遷移的機(jī)制。

SMCs；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α；再狹窄；血管內(nèi)膜；損傷

經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)在冠心病治療中已得到日益廣泛的應(yīng)用，但在臨床上也面臨著一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)——那就是術(shù)后再狹窄的發(fā)生，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)再狹窄預(yù)防進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究及臨床試驗(yàn)，但并未完全解決PCI術(shù)后再狹窄問(wèn)題，為有效降低再狹窄發(fā)生率，人們對(duì)PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了更深入的研究和探討。

人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)再狹窄發(fā)生是中膜SMCs表型轉(zhuǎn)化后遷移到內(nèi)膜不斷增殖，不斷分泌細(xì)胞基質(zhì)的結(jié)果[1]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)大鼠再狹窄動(dòng)物模型觀察內(nèi)膜增生時(shí)中膜SMCs表型轉(zhuǎn)化及細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)的變化，同時(shí)觀察TGFα在內(nèi)膜增生過(guò)程中表達(dá)的變化，為PTCA術(shù)后再狹窄發(fā)生機(jī)制的研究提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 頸總動(dòng)脈球囊損傷大鼠動(dòng)物模型的制備

取Sprague-Dawle大鼠（體質(zhì)量400～500g，雄性，由廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）40只用戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉后；在頸前作一正中切口，鈍性分離左右頸總動(dòng)脈，結(jié)扎遠(yuǎn)側(cè)段，近端線拉阻斷血流。在兩線間靠剪一小口，緩慢逆行插入PTCA球囊導(dǎo)管，維持壓力為3大氣壓，緩慢回拉導(dǎo)管平切口處，再減壓至零。重復(fù)3次后退出導(dǎo)管。最后縫合切口，給予青霉素20萬(wàn)單位肌注以預(yù)防感染。術(shù)后1d、3d、9d、28d和2月處死動(dòng)物。按照取材時(shí)間隨機(jī)分成5個(gè)亞組，每個(gè)亞組各8只。

1.2 頸總動(dòng)脈的病理切片檢查

動(dòng)物處死后取下雙側(cè)血管標(biāo)本，左側(cè)未損傷血管標(biāo)本作實(shí)驗(yàn)內(nèi)對(duì)照。標(biāo)本固定后、切片后常規(guī)蘇木精-伊紅染色，光鏡觀察形態(tài)學(xué)變化。以?xún)?nèi)彈力膜與內(nèi)膜面之間組織為新生內(nèi)膜，以外彈力膜與內(nèi)彈力膜之間組織為中膜，計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定中膜厚度、內(nèi)膜面積、內(nèi)膜面積增生比率=內(nèi)膜面積/（內(nèi)膜面積+中膜面積）×100%。

1.3 透射電鏡觀察

取大鼠損傷頸動(dòng)脈和血管標(biāo)本，大小約1mm3，4℃固定后經(jīng)磷酸緩沖液浸洗后，用1%的四氧化鋨后固定固定30min，沖洗后1%水質(zhì)醋酸鈾染色。PBS沖洗；12h后70%酒精梯度逐級(jí)脫水后，包埋、超薄切片，以醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，用透射電鏡觀察。

1.4 TGFα含量的放免測(cè)定

取術(shù)后第3天處死的大鼠左右頸總動(dòng)脈標(biāo)本研磨制勻漿，按TGFα放免測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定，在自動(dòng)ā計(jì)數(shù)儀上測(cè)放射性，并得出樣品TGFα濃度（pg/mL）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

實(shí)驗(yàn)中1只大鼠因手術(shù)意外而死亡，其余動(dòng)物都在術(shù)后存活直至完成本實(shí)驗(yàn)。

2.1 光鏡觀察結(jié)果

對(duì)側(cè)正常血管切片的內(nèi)彈力膜完整，內(nèi)膜由單層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，無(wú)SMCs侵入。而球囊損傷后可見(jiàn)明顯的內(nèi)膜損傷及過(guò)度修復(fù)所致的內(nèi)膜增生。術(shù)后第3天即可見(jiàn)內(nèi)膜，中膜和外膜都有明顯增厚，中膜可見(jiàn)大量梭形SMCs，排列紊亂。術(shù)后第9天時(shí)內(nèi)膜進(jìn)一步增厚，新生內(nèi)膜中可見(jiàn)大量SMCs，纖維成分增多。28d時(shí)新生內(nèi)膜進(jìn)一步增厚，但內(nèi)膜中SMCs數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)大量細(xì)胞間質(zhì)堆積。2月后的血管標(biāo)本的病理變化與術(shù)后第28天時(shí)相似，細(xì)胞間質(zhì)替代SMCs成為增生內(nèi)膜的主要成分。

2.2 病理圖象分析結(jié)果

對(duì)側(cè)正常頸動(dòng)脈的中膜厚度、內(nèi)膜面積、外膜下面積的各亞組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)中，球囊損傷內(nèi)膜后3d，9d，28d和2月，新生內(nèi)膜面積分別0.05±0.020，0.13±0.06，0.24±0.09，0.25±0.07和0.24±0.08μm2。同時(shí)外膜下面積和內(nèi)膜加中膜面積也呈現(xiàn)出相應(yīng)的時(shí)相變化。損傷后3d，9d，28d和2月的內(nèi)膜/內(nèi)膜加中膜面積分別為0.166±0.127，0.326±0.209，0.305±0.509和0.312± 0.484（與對(duì)側(cè)正常頸動(dòng)脈比較均為P＜0.05）。在對(duì)血管中膜厚度的觀察我們也發(fā)現(xiàn)：內(nèi)膜損傷后不久，中膜即出現(xiàn)增厚，并在第3天有一個(gè)明顯的高峰（與對(duì)側(cè)正常血管相比分別為202.67±8.45和132.39±19.20，P＜0.01），而到第9天時(shí)雖然內(nèi)膜明顯增生，但中膜厚度卻已恢復(fù)到正常血管厚度。

2.3 透射電鏡觀察結(jié)果

由透射電鏡可看到：從術(shù)后第3天，增生的內(nèi)膜中近腔面的SMCs就已主要表現(xiàn)為合成表型：細(xì)胞異形，胞漿內(nèi)細(xì)胞器增多，可見(jiàn)大量的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和高爾基體等，肌絲則明顯減少，同時(shí)可見(jiàn)較多炎性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。到術(shù)后28d，在增生內(nèi)膜中大部分的SMCs都恢復(fù)為梭形的收縮表型，胞漿內(nèi)細(xì)胞器減少，但部分細(xì)胞的胞漿中仍可見(jiàn)溶酶體、線粒體等細(xì)胞器的增生，細(xì)胞間有大量的膠原纖維堆積，并可見(jiàn)巨噬細(xì)胞，增生內(nèi)膜表面未見(jiàn)到有內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋。

2.4 TGFα含量的放免測(cè)定

根據(jù)自動(dòng)γ計(jì)數(shù)儀上放免測(cè)定的結(jié)果顯示：在球囊損傷第3天后損傷動(dòng)脈組織標(biāo)本中的TGFα含量為（187.46±105.63）pg/g，而對(duì)側(cè)正常頸動(dòng)脈標(biāo)本中測(cè)定的TGFα含量為（89.11±101.87）pg/g，兩組比較其TGFα含量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異，P=0.0028＜0.01。

3 討 論

血管成形術(shù)術(shù)后再狹窄發(fā)生機(jī)制主要與中層少數(shù)SMCs遷移到內(nèi)膜不斷增殖，不斷分泌細(xì)胞基質(zhì)有關(guān)，而SMCs的表型轉(zhuǎn)化正是其此后遷移和增殖的啟動(dòng)環(huán)節(jié)。SMCs在局部環(huán)境的損傷信號(hào)調(diào)控下可發(fā)生去分化，由收縮表型轉(zhuǎn)化成胚胎和新生兒期才出現(xiàn)的合成表型，形態(tài)和結(jié)構(gòu)功能上都可發(fā)生了明顯變化[1]。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)透射電鏡看到SMCs在內(nèi)膜增生過(guò)程中存在這種表型變化特點(diǎn)，與Masakiyo N.的觀察結(jié)果一致[2]，而SMCs表型的這種雙向轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)可能也是內(nèi)膜增生具有一定的自限性、時(shí)限性的原因。而中膜厚度的時(shí)相性性變化可能與中膜表型轉(zhuǎn)化SMCs向內(nèi)膜的遷移有關(guān)。

SMCs的表型轉(zhuǎn)化是其以后遷移和增殖的基礎(chǔ)，而誘導(dǎo)SMCs表型轉(zhuǎn)化和增生主要與局部的多肽生長(zhǎng)因子有關(guān)[3]，其中TGFα可能在其中起著重要作用。TGFα多存在于胚胎組織和腫瘤組織中，是組織分化發(fā)育和腫瘤形成過(guò)程中重要調(diào)控因子，也通常被認(rèn)為是胚胎組織中EGF受體的主要配基。轉(zhuǎn)化細(xì)胞表面的EGF受體常明顯上調(diào)，并與TGFα一起形成促使轉(zhuǎn)化細(xì)胞自主性生長(zhǎng)的自分泌環(huán)[3]，現(xiàn)人們已發(fā)現(xiàn)：表型轉(zhuǎn)化后大量增殖SMCs具有胚胎期細(xì)胞的一些特點(diǎn)，而EGF受體數(shù)量也明顯增加[4]，同時(shí)有學(xué)者也發(fā)現(xiàn)高血壓大鼠的血管SMCs中TGFα的表達(dá)明顯升高[5]，我們也發(fā)現(xiàn)：內(nèi)膜損傷后，TGFα在損傷血管局部組織中的含量明顯升高，較正常血管組織增加一倍以上。提示TGFα/EGFR信號(hào)通路對(duì)PCI術(shù)后再狹窄過(guò)程中的SMCs的表型轉(zhuǎn)化和過(guò)度增殖可能起著重要的信號(hào)調(diào)節(jié)作用。

[1] Mugabe BE,Yaghini FA,Song CY,et al.Angiotensin II-induced migration of vascular smooth muscle cells is mediated by p38 mitogen-activated protein kinase-activated c-Src through spleen tyrosine kinase and epidermal growth factor receptor transactivation[J].J Pharmacol Exp Ther,2010,332(1):116-124.

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R541.4

B

1671-8194（2013）01-0073-02

湖南省科技廳重點(diǎn)課題項(xiàng)目（No．2009SK2010）和湖南省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（No．11JJ2046）

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