劉桂林，竇迎春，喬 云

血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）的損傷與功能障礙在動(dòng)脈粥樣硬化（AS）進(jìn)展中具有重要的作用。減少內(nèi)皮細(xì)胞損傷，改善和提高血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙成為防治AS的一種新思路。三七總皂苷（total panax notoginsenosides，TPNS）是中藥三七的主要活性成分。臨床TPNS及其制劑廣泛應(yīng)用于AS、高脂血癥及冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等血管性疾病的治療中，具有良好的調(diào)脂、抗氧化、抗血小板聚集作用[1]。TPNS可降低氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞分化抗原40（CD40）、血管細(xì)胞黏附分子－1（VCAM－1）的基因及蛋白表達(dá)水平[2]。本研究采用體內(nèi)研究方法，觀察了TPNS對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠血管內(nèi)皮的保護(hù)作用，分析其可能機(jī)制，進(jìn)一步闡明抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與藥物 8周齡雄性載脂蛋白E基因敲除（apoE－KO）小鼠24只，同種屬C57BL／6J小鼠8只，SPF級(jí)，均購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證SCXK（京）2006－0008。TPNS粉末購(gòu)自山東省藥品檢驗(yàn)所。辛伐他汀片（舒降之，杭州默沙東制藥生產(chǎn)，批號(hào)H10970385）。

1.1.2 儀器與試劑 紫外分光光度儀（Beckman counter DU800，America）；酶標(biāo)儀（DV800，Bechman，America）；全自動(dòng)生化分析儀（Hitachi 917Roche Diagnostics，Germany）；Tgradient96型 PCR熱循環(huán)儀（Whatman Biometra，Germany）；Light－Cycler型熒光實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)（Roche Diagnostics，Germany）。主要試劑：氧化修飾的低密度脂蛋白ELISA測(cè)定試劑盒（E0527m）；Trizol、Oligo dT和dNTP購(gòu)自Invitrogen公司；MMLV購(gòu)自Promega公司；熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 apoE－KO 小鼠給予高脂飲食喂養(yǎng)（15%脂肪，0.25%膽固醇，84.75%的基礎(chǔ)飼料）。12周后，隨機(jī)分為模型組、三七總皂苷組、辛伐他汀組，每組8只。三七總皂苷組給予TPNS 60mg／kg灌胃，1次／日；辛伐他汀組給予辛伐他汀3.3mg／kg灌胃，1次／日；模型組給予生理鹽水0.2mL灌胃，1次／日；灌胃時(shí)間為8周。C57BL／6J小鼠給予正常飼料，作為正常對(duì)照組，給予生理鹽水0.2mL灌胃8周。

1.2.2 透射電鏡觀察 剪取長(zhǎng)約1mm主動(dòng)脈弓，3%戊二醛前固定，0.2mol／L磷酸緩沖液沖洗3次，1%四氧化鋨固定2 h，0.2mol／L磷酸緩沖液再?zèng)_洗3次，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，制成超薄組織切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛溶液染色，置于銅網(wǎng)上，在H－7000FA透射電子顯微鏡下60－80kV加速電壓，6 000～20 000放大倍率，觀察動(dòng)脈壁內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，選取典型視野拍照。

1.2.3 血清oxLDL檢測(cè) 小鼠麻醉后摘眼球取血1mL，4℃3 000r／min離心15min，分離血清。采用ELISA法測(cè)定血清oxLDL濃度。

1.2.4 總RNA提取及cDNA合成 取約1cm凍存的胸主動(dòng)脈，用紫外分光光度儀測(cè)OD260／OD280，所有標(biāo)本該值均在1.7～2.0。用Oligo dT、dNTP和 M－MLV在PCR熱循環(huán)儀上將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件為42℃60min，95℃5 min。

1.2.5 熒光實(shí)時(shí)定量RT－PCR檢測(cè)CD40、VCAM－1的mRNA含量 小鼠CD40、VCAM－1與內(nèi)參基因β－actin引物由上海博亞公司（Bio Asia）合成，引物序列為：CD40（157bp）上游 GCTATGGGGCTGCTTGTTGA； 下 游 ATGGGTGGCATTGGGTCTTC。VCAM－1（157bp）上 游 5’－TGCCGGCATATACGAGTGTGA－3’；下游5’－CCCGATGGCAGGTATTACCAAG－3’。β－actin（171bp）上游5’－CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC－3’；下 游5’－ATGGAGCCACCGA－TCCACA －3’。反應(yīng)體系：cDNA 1μL，上下游引物各1μL，SYBR GreenI 10μL，加無(wú)菌雙蒸水至20μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10s，57℃（CD40）、55℃（VCAM－1）、54℃（β－actin）退火5s，72℃延伸10s，共45個(gè)循環(huán)，最后40℃30s結(jié)束反應(yīng)。采用Livak等[3]報(bào)道的2－ΔΔCT 方法對(duì) CD40、VCAM－1的 mRNA 表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析，VCAM－1的擴(kuò)增倍數(shù)用比正常野生型C57BL／6J小鼠基因擴(kuò)增的增高倍數(shù)表示。

2 結(jié) 果

2.1 血清oxLDL含量變化 模型組oxLDL與正常組相比明顯增高（16.06ng／mL±4.16ng／mL vs 1.43ng／mL±0.84 ng／mL，P＜0.001）。與模型組相比，TPNS及辛伐他汀治療后均明顯降低apoE－KO小鼠血清oxLDL含量（16.06ng／mL±4.16ng／mL vs 4.45ng／mL±1.25ng／mL，3.92ng／mL±1.99 ng／mL，P＜0.001）。

2.2 主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變 正常VEC為單層扁平細(xì)胞，連續(xù)性好，胞膜平整，胞漿均勻，緊貼內(nèi)彈性膜，線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。內(nèi)彈性膜連續(xù)，厚度均勻。模型組VEC可見(jiàn)細(xì)胞核固縮，有明顯的內(nèi)皮細(xì)胞脫落現(xiàn)象，并可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。胞核固縮，核內(nèi)異染色質(zhì)明顯增多，邊集于核膜下，線粒體空泡化，脊腫脹、溶解。三七總皂苷組、辛伐他汀組與模型組相比，VEC形態(tài)有不同程度的改善，胞漿內(nèi)可見(jiàn)微絲及吞飲小泡，胞核內(nèi)染色質(zhì)相對(duì)均勻，線粒體數(shù)目略增多，形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，內(nèi)皮連續(xù)無(wú)中斷。內(nèi)彈性膜連續(xù)，厚度均勻。

2.3 VCAM－1mRNA表達(dá)結(jié)果 模型組VCAM－1的mRNA表達(dá)較正常增高了7.65倍，TPNS干預(yù)組VCAM－1的mRNA表達(dá)下降至正常的4.38倍，辛伐他汀組下降至正常的3.11倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.4 CD40mRNA表達(dá)結(jié)果 模型組CD40的mRNA表達(dá)較正常增高了54.15倍，TPNS干預(yù)組CD40的mRNA表達(dá)下降至正常的15.52倍 ，辛伐他汀組下降至正常的16.19倍，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞層不僅是血液與組織間的屏障，而且是十分活躍的代謝及內(nèi)分泌器官，VEC結(jié)構(gòu)和功能的改變?cè)谛难芗膊〉陌l(fā)生發(fā)展中起十分重要的作用。近年來(lái)，Ross提出的“損傷反應(yīng)”學(xué)說(shuō)認(rèn)為，VEC的損傷和功能失調(diào)是AS發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)。oxLDL導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙在AS的病理過(guò)程中起關(guān)鍵作用。oxLDL具有細(xì)胞毒性，可引起內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)損傷，而且能夠降低內(nèi)皮細(xì)胞的抗纖溶活性和舒血管功能[4]。oxLDL還能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)多種黏附分子，增強(qiáng)單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的黏附及向內(nèi)膜下移行，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成及AS斑塊的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)，oxLDL可刺激多種炎癥因子如腫瘤壞死因子－α、白介素－1、白介素－8等的表達(dá)，加速 AS炎癥反應(yīng)[5，6]。

本研究用電鏡觀察小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)，正常小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮光滑完整，而動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞有不同程度的損傷。模型組小鼠血清oxLDL水平明顯高于正常組，三七總皂苷組小鼠血清oxLDL水平有顯著降低，提示三七總皂苷可通過(guò)降低apoE－KO小鼠血清oxLDL水平保護(hù)血管內(nèi)皮。

CD40屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員。AS斑塊及培養(yǎng)的人VECs、VSMCs、M均可表達(dá)CD40及其配體CD40L，并且oxLDL可促進(jìn)CD40、CD40L的表達(dá)[7]。CD40與其配體結(jié)合后可誘導(dǎo)VECs，VSMCs表達(dá)黏附分子如VCAM－1、細(xì)胞間黏附分子－1、E－選擇素等，誘使免疫成分細(xì)胞黏附到血管壁[8]。并且還可以促進(jìn)VECs，T細(xì)胞表達(dá)和釋放化學(xué)因子如白介素－6、巨噬細(xì)胞炎性蛋白－1和單核細(xì)胞趨化因子－1等，吸引和支配T細(xì)胞、M到AS斑塊內(nèi)，維持慢性炎性反應(yīng)，促進(jìn)AS斑塊的發(fā)展[9]。本研究中，模型組小鼠主動(dòng)脈CD40基因有明顯的表達(dá)，這與以往的研究相符。三七總皂苷組小鼠主動(dòng)脈CD40的基因表達(dá)水平顯著降低，這可能與三七總皂苷降低oxLDL的水平有關(guān)。

VCAM－1是一種重要的細(xì)胞黏附分子，屬免疫球蛋白超家族成員，又稱(chēng)誘導(dǎo)性細(xì)胞黏附分子。VCAM－1通過(guò)與配體相互作用參與T細(xì)胞－T細(xì)胞、T細(xì)胞－基質(zhì)殺傷細(xì)胞－靶細(xì)胞之間的相互作用，與炎癥免疫反應(yīng)密切相關(guān)[10，11]。VCAM－1可在多種促炎因子刺激的VECs，VSMCs中表達(dá)[12]，用基因敲除或抗體阻斷VCAM－1的表達(dá)可降低單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，延緩AS進(jìn)程[13，14]。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠主動(dòng)脈 VCAM－1的表達(dá)明顯高于正常組，三七總皂苷組小鼠主動(dòng)脈VCAM－1的表達(dá)較模型組顯著降低，提示長(zhǎng)期口服三七總皂苷可降低apoE－KO小鼠的主動(dòng)脈VCAM－1的表達(dá)，抑制AS中免疫相關(guān)細(xì)胞的黏附，從而延緩AS的進(jìn)展。

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