劉中勇,李 林,方 家,陳寧南,鄧 鵬,方險峰,鄒國輝
中醫(yī)學(xué)認(rèn)為婦女在絕經(jīng)后機體開始向老年過渡。此時腎氣漸衰、天癸漸竭,女子以血為用,因數(shù)脫于血,且精血同源,故絕經(jīng)后相關(guān)疾病以腎陰虛者多見[1,2]。在更年期綜合征中醫(yī)研究中,本病大多被認(rèn)為屬腎陰虧虛[3,4]。中醫(yī)證型與性激素相關(guān)性研究也表明,促卵泡生成激素(FSH)、促黃體生成素(LH)升高,雌二醇(E2)下降,血清中NO水平明顯降低均為腎陰虛型[5,6]。腎為先天之本,通過其“藏精化血”,“主骨生髓、髓生血”的功能直接參與氣血活動,由于腎與血在生理上關(guān)系密切,因此,在病理上近代有關(guān)“腎虛血瘀”的論述頗多,認(rèn)為腎虛必兼血瘀?!澳I虛血瘀”也是婦女發(fā)生絕經(jīng)后冠心?。╟oronary heart disease,CHD)的主要病機[7,8]。應(yīng)用原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為載體,加入eNOS抑制劑L-NAME處理細(xì)胞,制備NO低表達(dá)細(xì)胞模型,觀察補腎活血方劑對原代細(xì)胞NO分泌的提高作用。
1.1 材料 標(biāo)本采自江西中醫(yī)藥大學(xué)婦產(chǎn)科正常分娩的新生兒臍帶。健康孕婦剖宮產(chǎn)后,無菌條件下剪取臍帶20cm,浸泡在磷酸鹽緩沖液中。立即對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)進(jìn)行分離培養(yǎng)。
1.2 儀器及試劑 DMEM培養(yǎng)基GIBCO公司,0.25%胰酶(廣州杏海生物,Ginbio),Ⅷ抗體(武漢博士德),I型膠原酶(sigma公司),F(xiàn)ITC標(biāo)記熒光二抗(武漢博士德),胎牛血清(杭州四季青),青鏈霉素雙抗(廣州杏海生物,Ginbio),NO檢測試劑盒(上海碧云天),倒置顯微鏡(NIKO),熒光顯微鏡 (Leica),超凈工作臺(江蘇蘇凈),酶標(biāo)儀(BIOTEK)。
1.3 樣品采集 取剖宮產(chǎn)新生兒臍帶,注入NaCl至靜脈另一端流出液體透明為止。把37℃預(yù)熱的0.1%Ⅰ型膠原酶注入臍靜脈至下端溶液流出,用止血鉗夾閉下端靜脈,繼續(xù)向靜脈內(nèi)注入膠原酶,用另一個止血鉗夾閉靜脈上端,將臍帶放入37℃CO2孵育箱中消15min。消化完畢后,松開臍帶兩端止血鉗,收集靜脈沖洗液,1 000r/min離心5min,棄上清。細(xì)胞重懸于RMPI1640培養(yǎng)液中,13%胎牛血清,置37℃,5%CO2孵育箱中培養(yǎng)。隔2d~4d更換1次培養(yǎng)基直至長成單層細(xì)胞。原代細(xì)胞生長融合至80%以上,用0.25%胰酶消化2min,1∶2傳代。
1.4 細(xì)胞因子Ⅷ免疫熒光染色 以每孔2×104/mL細(xì)胞密度接種24孔培養(yǎng)板做細(xì)胞爬片,培養(yǎng)24h,PBS洗3次,4%多聚甲醛室溫固定15min,-20℃預(yù)冷甲醇通透10min,5%羊血清室溫封閉1h,加小鼠抗人Ⅷ單抗(空白對照用PBS替代),4℃過夜。PBS洗3×5min,生物素山羊抗小鼠二抗室溫反應(yīng)30 min,PBS洗3×5min。DAPI染色5min,熒光顯微鏡觀察。
1.5 藥物處理 補腎活血方:熟地黃20g,山萸12g,山藥12 g,澤瀉9g,丹皮9g,茯苓9g,丹參15g,水蛭3g。煎煮過濾除菌,低溫保存?zhèn)溆谩?/p>
1.6 含藥血清制備 選用日本純種大白兔二只,其中一只分別每日分2次給予補腎活血方總量15g/kg;另一對照組每日給予等量溫開水(15mL),灌胃10d后,于取血前12h、6h、3h、1h再各灌胃1次,并于取血前24h禁食(不禁水),心臟采血,取血后無菌分離血清,經(jīng)56℃、30min滅活處理后,用0.45μm的微孔濾膜過濾除菌,置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.7 濃度血清制備 對照組:將15mL正常兔血清、5mL新生牛血清加入80mLRPMI1640液至100mL;不同濃度含藥血清(即20%、10%、5%):將20mL、10mL、5mL含丹地劑血清分別加入至每瓶有5mL新生牛血清、75mLRPMI1640液中,后兩組分別再補充正常兔血清15mL、20mL,使三組總量分別至100mL。
E2組:將17β-雌二醇用 RPMI1640液配成0.01μmol/L??瞻捉M為不含兔血清,單純?yōu)榕囵B(yǎng)液。
取對數(shù)生長細(xì)胞鋪種六孔板,每孔5×105細(xì)胞,每組3復(fù)孔。加eNOS抑制劑L-NAME按照10-6mol/L加入除空白組外所有組,預(yù)孵育1h加入不同劑量含藥血清繼續(xù)培養(yǎng)至24h收集上清液檢測NO含量,提取蛋白質(zhì)做Western blot檢測。
1.8 細(xì)胞上清液中NO濃度測定 取出Griess ReagentⅠ和Ⅱ,使恢復(fù)室溫 ,取細(xì)胞上清液或者標(biāo)準(zhǔn)品50μL加試劑Ⅰ和試劑Ⅱ各50μL。酶標(biāo)儀540nm檢測吸光度,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品濃度。
1.9 Western blot檢測蛋白eNOS蛋白表達(dá) 0.01mol/LPBS洗滌細(xì)胞兩次,每孔加入100μL RIPA裂解液,置冰上裂解20 min后,用干凈的細(xì)胞刮刷將細(xì)胞刮于孔的一側(cè),然后用移液器將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5mL離心管中,4℃,12 000r/min離心5min,取上清。采用BCA蛋白定量試劑盒檢測。剩余樣品按比例加入5Xloading buffer,煮沸10min,分裝后-20℃保存。每個樣品取30μg置于10%SDS-PAGE凝膠上電泳分離,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。室溫下用5% 脫脂奶粉封閉1h。eNOS抗體以封閉液按照1∶500的比例稀釋,與PVDF膜一起封閉在雜交袋中4℃過夜后,與1∶6 000稀釋的羊抗兔IgG,室溫孵育1h。用SuperECL Plus超敏發(fā)光液按試劑說明要求顯影、曝光。用Quantity one分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值數(shù)字化。目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDH(1∶1 000)的灰度值以校正誤差,所得結(jié)果即為樣品中eNOS蛋白相對表達(dá)量。
1.10 統(tǒng)計學(xué)處理 運用SPSS 15.0軟件包分析,實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。
2.1 細(xì)胞分離 用1%I型膠原酶消化20cm長臍帶所收獲的內(nèi)皮細(xì)胞,接種于6cm培養(yǎng)皿,密度為105/mL~106/mL。接種4h后細(xì)胞開始貼壁,12h后大部分貼壁,24h后即可第一次換液除去未貼壁的紅細(xì)胞。早期的內(nèi)皮細(xì)胞多呈小多角形、球形、短梭形,細(xì)胞單層生長,互不重疊。當(dāng)原代細(xì)胞接種密度達(dá)到105/mL~106/mL時,在接種48h~72h生長最旺盛,4d~5 d即可融合。融合后的HUVEC為扁平多角形,呈典型的鵝卵石或鋪路石樣排列。細(xì)胞胞核清晰,細(xì)胞核為圓形或橢圓形,核內(nèi)染色質(zhì)稀疏空亮,核仁1~2個。免疫熒光顯示,細(xì)胞與FITC標(biāo)記的Ⅷ蛋白結(jié)合,在熒光顯微鏡下呈綠色熒光,表明細(xì)胞表達(dá)Ⅷ蛋白,DAPI染色細(xì)胞核呈藍(lán)色。
2.2 細(xì)胞上清液中NO濃度 eNOS抑制劑與藥物處理細(xì)胞24h后。NC組(只加L-NAME)與空白組比較,NO含量明顯減少(5.64μmol/L±0.12μmol/L,P<0.05)。陽性對照藥物雌二醇處理組明顯升高NO含量(13.52μmol/L±0.19μmol/L)。藥物處理組提高內(nèi)皮細(xì)胞被L-NAME抑制的NO分泌。20%、10%、5%含藥血清處理 NO含量分別為(11.51μmol/L±0.68μmol/L,P<0.05),(10.45μmol/L±0.36μmol/L,P<0.05),(7.50μmol/L±0.45μmol/L,P>0.05)。
正常的內(nèi)皮功能對于血管壁具有重要的保護(hù)作用,血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動脈粥樣硬化及許多疾病的始動環(huán)節(jié)[9]。內(nèi)皮細(xì)胞損傷后發(fā)生的功能改變則是導(dǎo)致心血管疾?。ㄈ绺哐獕骸⑿乃?、冠心病、術(shù)后再狹窄、原發(fā)性肺動脈高壓等)發(fā)生發(fā)展的重要因素,同時也參與腎病、糖尿病等一些難治性疾病[10]。血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的NO不僅可以調(diào)節(jié)血管平滑肌張力,也能抑制血小板聚集、白細(xì)胞黏附以及平滑肌細(xì)胞增殖,還可以減輕氧自由基造成的血管內(nèi)皮功能障礙[11],被認(rèn)為是一種“內(nèi)源性的抗動脈粥樣硬化分子”[12]。NO是由NOS催化L-精氨酸轉(zhuǎn)化而來,NOS是其生物合成的關(guān)鍵限速酶。NO生成減少是血管內(nèi)皮功能不全的一個重要特征[13]。以血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙為共同特點的糖尿病、腦梗死、冠心病及高血壓等疾病患者,其血清NO水平明顯降低[14]。大量實驗證明,雌激素作用于內(nèi)皮細(xì)胞后,一氧化氮合酶(eNOS)的數(shù)量上調(diào)[15]。雌激素的心血管保護(hù)作用與一氧化氮有關(guān)。成功分離培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,觀察補腎活血方的研究表明,補腎活血方對更年期綜合征具有良好效果,對絕經(jīng)女性血脂構(gòu)成有正性作用。
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