楊建輝 魯葆春

泛素-蛋白酶體通路及其與膽道疾病相關(guān)性研究進(jìn)展

楊建輝 魯葆春

泛素-蛋白酶體通路（UPP）是真核生物細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)依賴于ATP、非溶酶體途徑的蛋白質(zhì)降解通路。UPP通路不僅能降解變性、異?；蚱鸲虝鹤饔玫牡鞍踪|(zhì)，而且能降解植物色素、轉(zhuǎn)錄因子、內(nèi)膜蛋白和細(xì)胞周期蛋白等天然蛋白質(zhì)，因而在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)降解、蛋白質(zhì)穩(wěn)定狀態(tài)調(diào)節(jié)、程序性細(xì)胞死亡、細(xì)胞周期控制和免疫介導(dǎo)等過(guò)程中起重要作用，因此泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解通路的異常與許多疾病，如惡性腫瘤、膿毒血癥所致肌肉萎縮等密切相關(guān)。筆者就UPP與膽道疾病相關(guān)性的研究進(jìn)展作一綜述。

1 UPP的組成

真核細(xì)胞主要有兩種蛋白質(zhì)降解通路，一種是溶酶體通路，主要降解經(jīng)胞吞進(jìn)入細(xì)胞的胞外蛋白質(zhì)；另一種是非溶酶體通路，即UPP，主要經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體降解泛素化蛋白質(zhì)。UPP主要由泛素（Ub）、泛素活化酶（E1）、泛素偶聯(lián)酶（E2）、泛素連接酶（E3）、泛素鏈延長(zhǎng)酶（E4）、去泛素化酶（DUB）、蛋白酶體等組成。

1.1 Ub Ub是真核細(xì)胞內(nèi)一種由76個(gè)氨基酸組成的球形熱穩(wěn)定蛋白，分子量為8.45kD，其結(jié)構(gòu)在真核細(xì)胞中高度保守，在不同生物體間組成Ub的氨基酸序列差別很小，如酵母和人的Ub僅有3個(gè)氨基酸序列的差別。因其在體內(nèi)廣泛存在、含量豐富而被稱為Ub。Ub以自由形式和復(fù)合物形式兩種存在，其功能位點(diǎn)為C2端的76位Gly殘基和Lys殘基，Gly殘基上的羧基能與靶蛋白的Lys殘基上的氨基形成異構(gòu)肽鍵。另外，不同Ub分子的Gly殘基與Lys殘基之間結(jié)合，可形成一條長(zhǎng)鏈[1]。Ub的功能主要是通過(guò)異構(gòu)肽鍵結(jié)合胞漿內(nèi)錯(cuò)誤折疊或半衰期較短的蛋白，并以此指導(dǎo)蛋白酶體依賴的蛋白質(zhì)降解。

1.2 Ub相關(guān)酶 蛋白的Ub化是由Ub相關(guān)酶啟動(dòng)的，是蛋白降解的關(guān)鍵步驟，是一種蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)。E1水解ATP釋放能量，使其半胱氨酸殘基（Cys）的氨基與UbC2端的Gly的羧基形成高能硫酯鍵，從而激活Ub。而后活化的Ub（E1-Ub復(fù)合物）轉(zhuǎn)?；饔帽晦D(zhuǎn)移到E2活性Cys上，并釋放出E1，以新的高能硫酯鍵結(jié)合形成E2-Ub復(fù)合物。E2-Ub復(fù)合物可直接與特定的靶蛋白形成Ub-蛋白復(fù)合物。而在大多數(shù)情況下，需通過(guò)E3這個(gè)底物連接因子先與靶蛋白特異性結(jié)合，E2-Ub才獲得與靶蛋白相互接近，繼而靶蛋白與E2酶連接的Ub結(jié)合，從而完成靶蛋白的Ub化。在啤酒酵母菌研究中發(fā)現(xiàn)，Ub鏈延長(zhǎng)酶E4，多個(gè)靶蛋白-E3復(fù)合物在其幫助下能連接形成長(zhǎng)Ub鏈，稱之為多聚Ub化修飾[2]。部分靶蛋白必須經(jīng)多聚Ub化修飾后才能被蛋白酶體識(shí)別水解[3]。

細(xì)胞內(nèi)同時(shí)存在去Ub化，是Ub化過(guò)程的逆轉(zhuǎn)。Ub-靶蛋白偶聯(lián)后，進(jìn)入26S蛋白酶體內(nèi)靶蛋白被降解，同時(shí)在特異性水解酶（去Ub化酶）的作用下能夠解離Ub分子，可被重復(fù)利用。去Ub化酶主要有兩大類：Ub羧基端水解酶（UCHs）和Ub特異性修飾酶（UBPs/USPs），均能催化水解Ub和底物蛋白之間的硫酯鍵，起到去Ub化作用，還能將錯(cuò)誤識(shí)別的底物從Ub化復(fù)合體中釋放出來(lái)，并重新釋放出Ub分子。UCHs屬于半胱氨酸蛋白酶，可以通過(guò)裂解UbC末端Gly將Ub分子從小的多肽底物上釋放出來(lái)，也參與多聚Ub鏈產(chǎn)生Ub單體的過(guò)程。UBPs含有2個(gè)短而保守的片段，即Cys盒和Hi盒，能將Ub分子從大的蛋白上移除。兩類酶都能參與去除和解聚底物蛋白質(zhì)上的多聚Ub鍵，從而防止多聚Ub在底物蛋白的聚集，而以Lys48方式連接的多聚Ub鏈結(jié)構(gòu)對(duì)去Ub化酶有對(duì)抗作用[4]。

1.3 蛋白酶體 蛋白酶體是Ub化蛋白的降解場(chǎng)所，存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，主要發(fā)揮生物性效應(yīng)是26S蛋白酶體。26S蛋白酶體包含1個(gè)20S核心蛋白酶和兩個(gè)19S調(diào)控復(fù)合物，20S是具有蛋白酶體催化活性的核心顆粒，由4個(gè)并列環(huán)狀中空?qǐng)A柱狀顆粒物構(gòu)成，兩端的顆粒物構(gòu)成2個(gè)α環(huán)，中間的顆粒物構(gòu)成2個(gè)β環(huán)。α環(huán)亞基負(fù)責(zé)靶蛋白的識(shí)別，而β環(huán)參與靶蛋白的降解，3個(gè)不同肽酶活性均位于β環(huán)的亞基上，分別為糜蛋白酶樣、胰蛋白酶樣和半胱氨酸蛋白酶樣活性。進(jìn)入26S蛋白酶體的蛋白質(zhì)被多次切割，最后形成3～22個(gè)氨基酸殘基的小肽。19S是具有調(diào)節(jié)功能的調(diào)節(jié)顆粒，由包含6個(gè)AAA-ATP酶的堿性亞復(fù)合體和包含8個(gè)非ATP酶的亞復(fù)合體組成，參與對(duì)靶蛋白的特異性識(shí)別。多聚Ub鏈形成后，可與蛋白酶體19S Ub受體相互作用，使靶蛋白去折疊進(jìn)入26S蛋白酶體催化中心被降解。

2 Ub-蛋白酶體通路的功能

Ub和蛋白酶體分別是整個(gè)UPP的起始環(huán)節(jié)和核心位點(diǎn)，利用Ub化或去Ub化可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平并影響其功能。研究已證實(shí)，Ub介導(dǎo)了細(xì)胞內(nèi)80%～90%的蛋白降解，參與了細(xì)胞周期循環(huán)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡及抗原遞呈等許多生命過(guò)程。

細(xì)胞周期調(diào)控因子Ub化，然后由26S蛋白酶體降解，導(dǎo)致周期因子依賴的激酶失活，從而使細(xì)胞有絲分裂期中止。p53作為轉(zhuǎn)錄因子可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期抑制因子和促凋亡基因的表達(dá)，當(dāng)DNA受到損傷或發(fā)生不正常的細(xì)胞增殖時(shí)p53就會(huì)被激活，使細(xì)胞周期停止或使細(xì)胞發(fā)生凋亡。Anwar等[5]用蛋白酶體抑制物MG-132處理黑色瘤細(xì)胞，p53蛋白水平升高，半衰期延長(zhǎng)，由此可見(jiàn)細(xì)胞中p53蛋白水平的調(diào)節(jié)主要是通過(guò)UPP通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中多種調(diào)節(jié)蛋白通過(guò)UPP活化和降解，控制著細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)、凋亡等過(guò)程，如UPP對(duì)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控。NF-κB是一多亞基組成的轉(zhuǎn)錄因子，其抑制因子IκB磷酸化后被26S蛋白酶體降解從而導(dǎo)致NF-κB以活性方式存在，相關(guān)的基因表達(dá)增強(qiáng)[6]。NF-κB可與IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)的基因啟動(dòng)子區(qū)域固定核苷酸序列結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。

抗原分子Ub化后被26S蛋白酶體降解成多肽，然后由組織相容性復(fù)合體MHC I類分子提呈至細(xì)胞表面，應(yīng)用蛋白酶體抑制劑可阻滯提呈至MHCⅠ類分子細(xì)胞表面多肽的產(chǎn)生。而膿毒癥狀態(tài)下的骨骼肌蛋白過(guò)度代謝亦是由UPP介導(dǎo)的?？梢?jiàn)免疫、炎癥反應(yīng)、各種病理狀態(tài)下的骨骼肌代謝等都與Ub-蛋白酶體通路有關(guān)。

3 Ub-蛋白酶體通路的調(diào)控

UPP降解許多蛋白，而這些蛋白帶有某些能被Ub系統(tǒng)識(shí)別的信號(hào)，稱作降解信號(hào)。有些天然蛋白，其降解信號(hào)被隱藏在疏水核心中，蛋白不被降解，但當(dāng)?shù)鞍捉Y(jié)構(gòu)變化出現(xiàn)部分解鏈區(qū)，降解信號(hào)就會(huì)暴露而被Ub系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)并降解，這證實(shí)為何部分折疊、異常和突變蛋白易被降解的原因。有些氨基酸序列就是降解的信號(hào)，如轉(zhuǎn)錄因子Gcn4p，有281個(gè)氨基酸，91～106位氨基酸序列稱為PEST序列，此蛋白正常的半衰期大約為5min，若將PEST序列移除，半衰期增加到50min。蛋白質(zhì)N-末端氨基酸序列可預(yù)測(cè)它的半衰期，即N-末端規(guī)則，如蛋白質(zhì)N-末端是天冬氨酸，半衰期為3min，若是絲氨酸，半衰期可長(zhǎng)達(dá)20h。一旦多聚Ub化鏈接到蛋白上，蛋白必將運(yùn)送到蛋白酶體，被展開(kāi)然后降解，這些步驟依賴于降解信號(hào)或靶蛋白自身特性的調(diào)控。

UPP被特異性調(diào)控，主要是E3對(duì)靶蛋白序列或降解信號(hào)來(lái)特異性地識(shí)別和降解，決定反應(yīng)的特異性。根據(jù)識(shí)別靶蛋白序列中結(jié)構(gòu)域不同，E3分為兩類：（1）HECT型E3連接酶，結(jié)構(gòu)域上的半胱氨酸殘基與E2攜帶的Ub以硫酯鍵連接形成復(fù)合物Ub-E3，再將Ub轉(zhuǎn)移到靶蛋白上[7]。（2）RING-finger E3連接酶，包含一個(gè)RING-finger結(jié)構(gòu)域，可以與Ub-E2形成復(fù)合體，但其本身不與Ub發(fā)生作用，不能以硫酯鍵直接與Ub結(jié)合，只是將Ub轉(zhuǎn)移給靶蛋白[8]。

4 Ub-蛋白酶體通路與膽道疾病的關(guān)系

4.1 UPP與膽道感染 急性重癥膽管炎（ACST）是在膽道完全梗阻的基礎(chǔ)上發(fā)生的一種嚴(yán)重的急性膽道感染，存在著細(xì)菌易位和腸源性內(nèi)毒素血癥。占全身單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)85%～90%的肝枯否細(xì)胞（KCs）是膽血屏障的重要組成部分，是清除來(lái)自膽道和腸道內(nèi)細(xì)菌及其內(nèi)毒素的主要場(chǎng)所。

ACST時(shí)，動(dòng)物血循環(huán)中內(nèi)毒素（LPS）水平顯著增加，KCs吞噬能力受到嚴(yán)重?fù)p害。而膽道梗阻后血循環(huán)中的脂多糖結(jié)合蛋白（LBP）水平也顯著提高[9]。LPSLBP復(fù)合物形成后，與KCs表面脂多糖受體CD14借助于糖基磷脂酸肌醇相結(jié)合并將LPS的刺激信號(hào)傳遞細(xì)胞內(nèi)，激活KCs胞漿內(nèi)的NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子。在靜息狀態(tài)下，NF-κB存在于胞質(zhì)內(nèi)并與抑制因子（IκB）結(jié)合形成無(wú)活性的三聚體復(fù)合物。ACST時(shí)，當(dāng)LPS的刺激信號(hào)傳人細(xì)胞內(nèi)后激活NF-κB誘導(dǎo)激酶，使IκB磷酸化，通過(guò)UPP被26S蛋白酶體降解，從而使NF-κB活化，并露出其核定位信號(hào)，特異性結(jié)合在DNA序列上，引起許多因子的轉(zhuǎn)錄，包括促炎因子IL-1β、IL-6等。Gong等[10]的研究表明，ACST患者外周血單核細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性明顯增強(qiáng)，其增強(qiáng)的程度與膽道感染的程度密切相關(guān)，并與患者的預(yù)后相關(guān)。

ACST時(shí)，膿毒癥發(fā)生率為100%，伴有嚴(yán)重的代謝性酸中毒，且常伴發(fā)1個(gè)或多個(gè)臟器的功能障礙。研究表明，膿毒癥時(shí)骨骼肌蛋白的降解是由于Ub-蛋白酶體途徑被激活的。內(nèi)毒素、TNF-α等介質(zhì)是直接或間接導(dǎo)致骨骼肌蛋白降解的重要誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)因子，抑制炎癥介質(zhì)NF-κB途徑可有效降低嚴(yán)重膿毒癥狀態(tài)下的骨骼肌蛋白降解率[11]。Mutsvangwa等[12]建立奶牛酸中毒模型研究酸性代謝中肌蛋白降解增加的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)ATP參與了其反應(yīng)過(guò)程，而溶酶體和鈣離子激活酶則未參與，酸中毒大鼠骨骼肌組織中UbmRNA量增加了25%、E2mRNA量增加了34%，蛋白酶體C8亞基mRNA增加了20%，從而進(jìn)一步證實(shí)UPP上調(diào)是酸中毒時(shí)骨骼肌流失的蛋白質(zhì)增加內(nèi)在機(jī)制。

4.2 UPP與膽道梗阻 急慢性膽道梗阻可引起膽汁性肝硬變，可伴隨機(jī)體負(fù)氮平衡，體重的減輕。Lin等[13]將成年雄性大鼠膽道結(jié)扎誘導(dǎo)膽汁性肝硬變，發(fā)現(xiàn)膽道結(jié)扎大鼠的肌肉蛋白降解率增高，Ub、Ub載體蛋白E2、蛋白酶體亞基C8和C2的基因表達(dá)增強(qiáng)，肌肉蛋白中游離Ub和結(jié)合Ub的水平均升高，而其中TNF-α在整個(gè)機(jī)制中起到了重要作用。Wang等[14]的研究表明，膽道結(jié)扎誘導(dǎo)膽汁性肝硬變大鼠，骨骼肌蛋白硝化、Ub化明顯加強(qiáng)，注射左旋-硝基精氨酸甲脂治療后骨骼肌Ub化水平明顯下降。在原發(fā)性膽汁性肝硬變患者研究中，免疫組化染色提示膽管上皮細(xì)胞Ub明顯提高，熊去氧膽酸可減少其表達(dá)[15]。

4.3 UPP與膽道腫瘤 E3為Ub蛋白酶體降解途徑中的關(guān)鍵酶，能特異性識(shí)別底物蛋白并使其Ub化，RING-finger E3連接酶以cullins蛋白作為模板裝配而成，cullin家族已發(fā)現(xiàn)有cul-1、cul-2、cul-3、cul4A、cul4B、cul-5和cul-7等7個(gè)成員；cul-1作為cullins蛋白代表性成員，其組裝的復(fù)合體具有典型的Ub連接酶活性。新近研究證實(shí)，cu1-1介導(dǎo)許多細(xì)胞相關(guān)的功能蛋白的降解過(guò)程，有效地調(diào)節(jié)著細(xì)胞周期進(jìn)程，其異常改變可能在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中有極重要作用。劉棟才等[16]的研究表明，膽囊腺癌Ub和cul-1表達(dá)陽(yáng)性率分別為51.9%和48.1%，明顯高于癌旁組織、腺瘤性息肉、慢性膽囊炎膽囊上皮，膽囊腺癌中Ub表達(dá)水平與cul-1表達(dá)水平呈高度一致性。劉燕雷等[17]采用免疫組織化學(xué)法結(jié)合蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)人膽道腫瘤組織、正常膽道組織及炎性組織中Ub蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)膽道腫瘤組織中Ub蛋白的表達(dá)顯著高于正常組織及炎性組織中Ub蛋白的表達(dá)，表明Ub蛋白在人膽道腫瘤組織中表達(dá)水平升高，可能與膽道系統(tǒng)腫瘤的惡性程度、疾病的進(jìn)程密切相關(guān)。

USP14屬于Ub特異性蛋白酶家族，Chuensumran等[18]采用實(shí)時(shí)定量PCR方法研究發(fā)現(xiàn)，在膽管細(xì)胞癌患者腫瘤組織中USP14基因表達(dá)明顯上調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤臨床病理特征、組織學(xué)分級(jí)相關(guān)，與病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無(wú)明顯相關(guān)。人突變基因p27表達(dá)蛋白是一種熱穩(wěn)定蛋白，主要抑制細(xì)胞周期因子E-CDK2復(fù)合體的活性，同時(shí)也能抑制細(xì)胞周期因子D-CDK4和細(xì)胞周期因子A-DK2復(fù)合體，還能下調(diào)細(xì)胞周期因子B的表達(dá)。p27蛋白的降解主要由受Ub介導(dǎo)的第187位蘇氨酸磷酸化引起的。Sasaki等[19]采用腺病毒誘導(dǎo)野生型 p27kip1突變，基因片段由 Thr-187/Pro-188（ACGCCC）轉(zhuǎn)為Met-187/Ile-188（ATGATC），然后轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞系TFK-1和HuCCT-1，引起表達(dá)p27 kip1蛋白的UPP降解通路受阻，p27 kip1蛋白大量堆積導(dǎo)致細(xì)胞在G0/G1期停留，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡及明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

5 結(jié)語(yǔ)

UPP是高效、廣泛、有選擇性的蛋白質(zhì)降解途徑，參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、免疫應(yīng)答等各種細(xì)胞生物學(xué)功能，其改變與膽道疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療密切相關(guān)，是研究膽道疾病的一個(gè)新靶點(diǎn)。胰島素在ACST膿毒癥狀態(tài)下具有直接調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)的作用，減少炎癥介質(zhì)分泌，抑制骨骼肌蛋白質(zhì)降解，其調(diào)節(jié)機(jī)制證實(shí)通過(guò)對(duì)UPP的研究而被了解。膽管腫瘤起病隱匿，預(yù)后差，UPP的研究對(duì)于闡明發(fā)病機(jī)制、推動(dòng)早期診斷及開(kāi)發(fā)分子靶向治療提供了新思路和新策略。

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2013-02-06）

（本文編輯：歐陽(yáng)卿）

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目（2011C33023）

312000 紹興市人民醫(yī)院普外科（肝膽外科）

魯葆春，E-mail：lbc111@yeah.net