崔立勛 張愛華 孫守英

[摘要]目的 采用發(fā)酵法從冬蟲夏草發(fā)酵液及菌絲體中提取、分離蟲草多糖。 方法 采用乙醇沉淀法分離冬蟲夏草發(fā)酵液和菌絲體中的多糖；采用苯酚硫酸法測定樣品中多糖含量。 結(jié)果 采用此法進(jìn)行制備、檢測，方法簡單快速，結(jié)果準(zhǔn)確，適宜推廣使用。結(jié)論 此法無需多糖純品，具有快速簡單、精確度高、靈敏度高、重現(xiàn)性較好的優(yōu)點，是檢測蟲草多糖含量的較優(yōu)方法之一。

[關(guān)鍵詞]發(fā)酵液；蟲草多糖；菌絲體蟲草多糖；分離純化；含量測定

[中圖分類號] R28???[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B???[文章編號] 2095-0616（2012）21-95-02

Purification and determination of Cordyceps polysaccharide

CUI?Lixun1??ZHANG?Aihua1??SUN?Shouying2

1.Heilongjiang Biotechnology Vocational College，Harbin 150025，China；2.Heilongjiang New Yisheng Pharmaceutical Co.，Ltd，Jixi 158200，China

[Abstract] Objective Using the method of inoculated fermentation to extract and separate the Cordyceps polysaccharide from the zymotic fluid and mycelium of Chinese caterpillar fungus. Methods Separated the polysaccharide of Chinese caterpillar fungus' zymotic fluid and mycelium in ethanol precipitation；survey and evaluate the polysaccharide content of samples in phenol-sulfuric acid method. Results It is profitable for using widely because of the fast， easy method and exact result for producing and detecting. Conclusion This method is one of excellent ways for detecting the Cordyceps polysaccharide contents and it doesn't need the polysaccharide from pure product. The advantages are fast and easy， high accuracy and sensitivity，and good reproducibility.

[Key words] Fermentation broth；Cordyceps polysaccharide；Mycelium of Cordyceps polysaccharide； Separation and purification； Content determination

冬蟲夏草首載于本草從新，味甘，性溫，歸肺、腎經(jīng)，具補(bǔ)肺益腎，止血化痰之功效。冬蟲蟲草中含量最高的活性物質(zhì)是蟲草多糖，因其可以抗氧化、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫力等功效而受廣大人群青睞，由于天然的活性成分來源有限，現(xiàn)多采用人工發(fā)酵法生產(chǎn)制備。作者用苯酚-硫酸法測定蟲草多糖含量。

1?材料

1.1?供試材料

蟲草菌株（青海省）；蒸餾水（雙蒸水）、發(fā)酵液精多糖Ⅰ和菌絲體精多糖Ⅱ；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）等。

1.2?儀器及設(shè)備

培養(yǎng)箱（常州市恒久儀器制造有限公司光照培養(yǎng)箱）；高壓蒸汽滅菌設(shè)備（雞西辰豐醫(yī)療器械制造有限公司YXQ.L-75型立式壓力蒸汽滅菌器）；大容量離心機(jī)（北京時代北利離心機(jī)有限公司GTR10-2）；紫外分光光度計（上海悅豐儀器儀表有限公司）等。

1.3?培養(yǎng)基配方

1.3.1?活化培養(yǎng)基（g/mL）?蔗糖溶液1.30%，葡萄糖溶液1.30%，蛋白胨0.01%，酵母粉0.065%，瓊脂0.5%，KH2PO4 0.025%，MgSO4·7H2O 0.012 5%，pH自然，培養(yǎng)溫度27℃。

1.3.2?發(fā)酵培養(yǎng)基（g/mL）?葡萄糖1.75%，蛋白胨0.02%，酵母粉0.062 5%， KH2PO4 0.025%，MgSO4·7H2O 0.012 5%， pH自然，溫度27℃[1]。

2?方法

2.1?配制培養(yǎng)基和滅菌

按體積向培養(yǎng)基中加入蒸餾水，加熱煮沸，調(diào)節(jié)pH值至中性，趁熱倒入容器中。高壓蒸汽滅菌，溫度121.9℃，時間20 min。滅菌完成，趁熱倒在平板上。

2.2?活化菌種

在無菌條件下，將冷凍完好的菌種接到培養(yǎng)基上，無光條件下27℃培養(yǎng)，培養(yǎng)菌絲潔白并生長旺盛且無雜菌后備用。

2.3?配制發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)

把培養(yǎng)基上的菌種快速接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在27℃條件下，無光培養(yǎng)192 h。

2.4?發(fā)酵液多糖的分離純化[2]

2.4.1?發(fā)酵液及透析袋的處理?發(fā)酵液在4 000 r/min條件下離心20 min，過濾得到上清液和沉淀（菌絲體）。將透析袋分成小段后，處理后在4℃條件下存放于冰箱保存待用。

2.4.2?發(fā)酵液多糖的提取?醇沉：將無水乙醇以3倍體積加于發(fā)酵液中，離心后得上清液，4℃條件靜置12 h后，在4 000 r/min離心15 min，過濾得沉淀，用乙醇洗滌。脫蛋白：用熱水將發(fā)酵液粗多糖溶解，冷卻后反復(fù)3次去蛋白。脫色：多糖溶液加1.5%活性碳去色素，透析：將脫色后的蟲草多糖溶液裝入透析袋中，在蒸餾水中透析24 h，將3倍體積乙醇加于透析后溶液中，在4℃條件下沉淀過夜，離心得沉淀物并干燥，制得發(fā)酵液精多糖[3]。

2.4.3?沉淀物的處理?用研缽研碎發(fā)酵所制得的菌絲體，加蒸餾水至體積的10倍，水浴加熱96～100℃條件下浸提3 h，反復(fù)浸提3次并將濾液合并，加入95%乙醇至4倍體積并低溫沉淀過夜，離心制得沉淀，然后用乙醇和丙酮各洗滌2次，干燥，得粗多糖。

2.5?發(fā)酵液多糖的測定[4]

2.5.1?制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線?將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL） 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL加入試管中，加蒸餾水至10.0 mL。用移液管分別移取2.0 mL加入比色管中。滴入重蒸苯酚溶液1.0 mL，震動搖晃均勻，立即加入濃硫酸5.0 mL搖勻，靜置10 min，水浴加熱30 min，溫度40℃。

在波長490 nm處，測定每個管的吸光度，得A值（以2.0 mL蒸餾水作為空白）。橫坐標(biāo)為蔗糖濃度，縱坐標(biāo)為吸光度A做標(biāo)準(zhǔn)曲線，制得回歸方程：y=0.004 3x+0.029 9。

2.5.2?測定樣品含量?將干燥至恒重的發(fā)酵液精多糖50 mg，用減量法稱取后放置在100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，作標(biāo)號Ⅰ。取樣品液Ⅰ 1.0 mL，按剛制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方法，測定多糖溶液A值，平行測定3次。計算得出含量[5]。

3?結(jié)果

3.1?蟲草多糖含量測定

冬蟲夏草的產(chǎn)地不同，提取率也不同，其有效成分多糖的含量用苯酚一硫酸法測定結(jié)果也不同，測定結(jié)果見表1。

3.2?與蒽酮一硫酸法比較

取北蟲草子實體，用蒽酮一硫酸法進(jìn)行測定，得到4個樣品的多糖含量數(shù)值分別為3.29%、3.50%、3.39%、3.30%，但是這種測定方法對于測定蟲草發(fā)酵液的胞外多糖重現(xiàn)性不好，對測定結(jié)果的少部分蛋白影響較大。

4?討論

4.1?濃硫酸對測定結(jié)果的影響

必須快速滴加濃硫酸，這樣才能使高溫瞬時產(chǎn)生，有利于多糖完全水解，如果滴加硫酸過慢，則不能產(chǎn)生高溫條件，則多糖水解不完全，會給測定結(jié)果造成誤差[6]。

4.2?苯酚對測定結(jié)果的影響

苯酚應(yīng)配制成一定濃度的溶液，并且在整個檢測過程中滴加苯酚動作要迅速，避免苯酚氧化變性，對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。

現(xiàn)在蟲草多糖的檢測方法中，主要測定是粗多糖含量。用苯酚一硫酸法測定時，不需要蟲草多糖的純品和高級精密儀器，優(yōu)點是靈敏度高、準(zhǔn)確性高、精確度高、重現(xiàn)性好、簡單快速等優(yōu)點，可以作為對蟲草多糖含量測定的最佳選擇方法之一。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 袁建國，程顯好，侯永勤，等.功能因子冬蟲夏草多糖的研究開發(fā)[J].中國食品添加劑，1999（2）：18-22.

[2] 韓永萍，林強(qiáng)，何緒文.蟲草菌絲體多糖的提取研究[J].中國食用菌，2007（6）：53-55.

[3] 來永斌，王琦，孫月.蛹蟲草多糖含量的測定及分析[J].中成藥，2001，23（7）：517-518.

[4] 閆文娟，李泰輝，唐芳永.廣東蟲草多糖的提取及含量測定[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004（30）：53-56.

[5] 魯曉巖.硫酸-苯酚法測定北冬蟲夏草多糖含量[J].食品工業(yè)科技，2002，23（4）：69-70.

[6] 王祖華，張柯，李永程.冬蟲夏草菌種的制備及液體培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].洛陽理工學(xué)院學(xué)報，2010，20（4）：10-12.

（收稿日期：2012-08-07）