鄒崢嶸 陳貝貝 邵俊杰 焦健 易楊華

[摘要] 目的 對葉瓜參中的多糖進行分析。 方法 應用現(xiàn)代提取分離方法和化學及光譜鑒定技術(shù)對多糖成分進行分離鑒定。 結(jié)果 從葉瓜參中分離鑒定了CFG-1、CFG-2 和CFG-3 等3種多糖成分。 結(jié)論 CFG-1由木糖、3-甲氧基葡萄糖和葡萄糖組成，其摩爾數(shù)比=2︰1︰1；CFG-2由木糖、喹納糖、3-甲氧基葡萄糖和葡萄糖組成，其摩爾數(shù)比=2︰1︰1︰1；CFG-3由喹納糖和葡萄糖組成，其摩爾數(shù)比=1︰1。葉瓜參多糖CFG-2的PTP1B酶活性抑制試驗顯示，對PTP1B酶具有顯著的抑制活性。

[關(guān)鍵詞]海參；葉瓜參；多糖；抗糖尿病

[中圖分類號] Q74???[文獻標識碼] B???[文章編號] 2095-0616（2012）21-91-02

Studies on the active polysaccharides from Cucumaria frondosa Gunnerus

ZOU?Zhengrong1??CHEN?Beibei1??SHAO?Junjie2??JIAO?Jian2??YI?Yanghua3

1. Jiangxi Normal University，Live Science College，Nanchang 330000，China；2. Dalian Hai Yan Tang Biology Co.，Ltd，Dalian 116021，China；3.Second Militaly Medical University，School of Pharmacy，Research Center for Marine Drugs，Shanghai 200433，China

[Abstract] Objective To analyse the polysaccharides from Cucumber frondosa Gunnerus. Methods Apply modern methods of isolation and spectrum for identification of the polysaccharides. Results 3 of polysaccharides：CFG-1，CFG-2，and CFG-3 were isolated and identified. Conclusion The CFG-1 was composed of D-xylose，3-O-methyl-D-glucose and D-glucose（mol.rate=2︰1︰1）.CFG-2 was composed of D-xylose，L-quinovose，3-O-methyl-D-glucose and D-glucose （mol.rate=2︰1︰1︰1）. CFG-3 were composed of L-quinovose and D-glucose （mol. rate=1︰1）. CFG-2 showed significant anti-diabeties activity in the PTP1B inhibition test.

[Key words] Sea Cucumber；Cucumaria frondosa Gunnerus；Polysaccharide；Anti-diabetes

海參為海洋棘皮動物，營養(yǎng)豐富、味美可口，具有極高的藥用價值，同人參、燕窩、魚翅齊名，是世界八大珍品之一。明代以后，海參收錄于本草，作為補益藥物[1]?，F(xiàn)代研究表明，海參具有提高記憶力、延緩性腺衰老、防止動脈硬化、糖尿病以及抗腫瘤等作用[2]。葉瓜參（Cucumaria frondosa Gunnerus）屬棘皮動物門（Echinodermata）、海參綱（Holothurcidea）、楯手目（Dendrochirotida）、瓜參科（Cucumariidae）的海洋動物。體長一般為50 mm，體型呈圓筒狀，體色為棕色或黑色，具有較厚的體壁和堅硬的角質(zhì)，觸手為5個。該物種廣泛分布于北極地區(qū)，俄羅斯、加拿大、挪威、英國等國海岸均有分布，此外從格陵蘭到馬薩諸塞的西大西洋水域也有分布[3]。多糖是海參的主要活性成分，主要有黏多糖巖和藻多糖兩種[4-5]。國外學者對葉瓜參中的皂苷有過研究[6-7]，但有關(guān)葉瓜參多糖的研究鮮有報導。本課題組先期對葉瓜參中的腦苷脂進行了研究[8]。本研究對加拿大紐西蘭海域的葉瓜參（C. frondosa Gunnerus）中的多糖成分進行了系統(tǒng)的化學分析和生物活性研究。

1?儀器與材料

1.1?實驗材料

葉瓜參新鮮樣品，2010年9月采自加拿大紐芬蘭海域，標本保存于第二軍醫(yī)大學海洋藥物研究中心。

1.2?儀器

GL-20G-Ⅱ冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；Alpha-1-2冷凍干燥儀，CHRIST（德國）；超濾裝置，上海摩速科學器材公司；BS110分析天平，Sartorius北京賽多利斯天平有限公司；BSZ-100自動餾分收集器，上海青浦滬西儀器廠； GC/MS：Finnigan Voyager GC/MS 聯(lián)用儀，配DB-5 石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）。HPLC條件：Aglient 1100 HPLC 儀，示差折光（RID）檢測器。

1.3?試劑

葡聚糖凝膠，Sephadex G-25 上海仕梵化學有限公司；鹽酸、硫酸、苯酚等均為分析純，由國藥集團化學試劑有限公司提供。

2?方法與結(jié)果

2.1?實驗方法

2.1.1?葉瓜參多糖的提取分離?取葉瓜參新鮮樣品，冷凍干燥，粉碎成20目凍干粉。將葉瓜參凍干粉1 000 g加入5倍量的60%乙醇冷浸并攪拌5 h。離心收集上清液，沉淀物繼續(xù)按上述步驟重復提取2次，合并上清提取液，減壓濃縮，得乙醇提取物。將乙醇提取物用5倍量水溶解，Sevage法去蛋白。水層溶液減壓濃縮，冷凍干燥，即為葉瓜參粗多糖，稱重，計算其得率為5.2%。將葉瓜參粗多糖樣品溶解于25倍量的蒸餾水中，利用超濾裝置，選用不同的超濾膜（截留分子量為10 KDa、5 KDa和500 Da）對葉瓜參粗多糖進行梯度超濾，得不同分子量的截留液。減壓濃縮，冷凍干燥，得不同分子量范圍的葉瓜參多糖。

2.1.2?葉瓜參多糖的純化?所得到的樣品再分別進行葡聚糖凝膠 Sephadex G-25柱層析，蒸餾水洗脫，硫酸—苯酚法跟蹤檢測洗脫液中的多糖含量，收集均一多糖組分。從分子量為10 KDa的截留液中分離得到CFG-1（得率為5.4%）、從分子量為5 KDa的截留液中分離得CFG-2（得率為6.3%）、從分子量為500 Da的截留液中分離得CFG-3（得率為6.7%）。上述葉瓜參多糖組分經(jīng)HPGFC檢測均單一吸收峰，經(jīng)紫外掃描不含蛋白質(zhì)和氨基酸。

2.1.3?葉瓜參多糖酸水解?取已純化的葉瓜參多糖各5 mg，溶于2.5 mL三氟乙酸溶液中，置于5 mL安瓿瓶中，充氮氣后進行封管。置于水浴中加熱反應5 h，然后取出減壓濃縮至干。加入5 mg鹽酸羥胺和吡啶1.5 mL，置于90℃水浴反應30 min，冷卻至室溫，加入1 mL醋酐，90℃水浴反應45 min，生成糖腈乙酸酯衍生物，溶于0.5 mL氯仿溶液，進行GC-MS分析。

GC-MS分析條件：色譜柱 HP-5石英毛細管色譜柱（30 m× 0.25 mm，0.25μm） ；柱溫 150℃（保持2 min）-300℃（保持10 min）汽化溫度 250℃；升溫速度 15℃/min；載氣（流量）氦氣（1.0 mL/min）；質(zhì)譜檢測器源溫200℃、EI電離源、電離電壓70 eV。

根據(jù)樣品測得的吸收峰的保留時間與標準糖進行對照，確定糖的組成。根據(jù)樣品測得的吸收峰的面積推測糖的摩爾數(shù)比。

2.1.4?葉瓜參多糖蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B抑制活性試驗?實驗材料和方法：應用大腸桿菌表達后得到蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B。實驗中，以 pNPP 為底物，在96孔或384孔平底微孔板內(nèi)檢測酶活性。底物pNPP經(jīng)PTP1B水解獲得的游離產(chǎn)物在405 nm處有非常強的光吸收，通過酶標儀監(jiān)測405 nm處光吸收強度變化，計算出樣品對酶活性的抑制率（%inhibition）。

2.2?實驗結(jié)果

CFG-1由木糖、3-甲氧基葡萄糖和葡萄糖組成，其摩爾數(shù)比=2︰1︰1；CFG-2由木糖、喹納糖、3-甲氧基葡萄糖和葡萄糖組成，其摩爾數(shù)比=2︰1︰1︰1；CFG-3由喹納糖和葡萄糖組成，其摩爾數(shù)比=1︰1。

葉瓜參多糖CFG-2的PTP1B 活性抑制試驗顯示，對PTP1B酶具有顯著的抑制活性，在20μg/mL的濃度下，抑制率為（94.57±1.66）%，表明此多糖具有抗糖尿病的作用，可進一步將其應用于抗糖尿病藥物或保健功能食品的研究開發(fā)。

[參考文獻]

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[8] 喇明平，邵俊杰，焦健，等. Three cerebrosides from the sea cucumber Cucumaria frondosa[J].Chinese Journal of Natural Medicines，2012，10（2）：105-109.

（收稿日期：2012-08-07）