趙靜 李庭凱 胡蘭貴 魏錦萍

[摘要] 目的 觀察東垣益氣膏對(duì)MMP-2和MMP-9在肺氣虛證大鼠模型支氣管和肺組織中的表達(dá)的影響。 方法 將50只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、玉屏風(fēng)組、東垣益氣膏低/高劑量組共5組，每組10只。采用煙熏造模法建立肺氣虛證大鼠模型，造模同時(shí)開(kāi)始灌胃東垣益氣膏，連續(xù)60 d。采用鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物方法檢測(cè)支氣管肺組織中MMP-2和MMP-9的表達(dá)。 結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組MMP-9、MMP-2在支氣管肺組織中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；給藥后與模型組比較，高劑量組和玉屏風(fēng)組MMP-9、MMP-2表達(dá)顯著減少，其中高劑量組優(yōu)于玉屏風(fēng)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論 東垣益氣膏可抑制支氣管肺組織中MMP-9、MMP-2的表達(dá)，在一定程度上阻止肺氣虛證模型的形成。

[關(guān)鍵詞]東垣益氣膏；肺氣虛證；基質(zhì)金屬蛋白酶

[中圖分類(lèi)號(hào)] R287???[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A???[文章編號(hào)] 2095-0616（2012）21-28-04

Dongyuan Yiqi ointment in lung-qi card rats matrix metalloproteinases express influence

ZHAO?Jing1??LI?Tingkai1??HU?Langui1??WEI?Jinping2

1.Shanxi Institute of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan 030012， China；2.China Institute for Radiation Protection， Taiyuan 030006， China

[Abstract] Objective To observe the Dongyuan Yiqi ointment on matrix metalloproteinase 2 and MMP-9 in the lung-qi deficiency syndrome in a rat model of bronchial and pulmonary tissue expression influence. Methods 50 SD rats were randomly divided into control group， model group， Yupingfeng group， Dongyuan Yiqi ointment low and high dose group. A total of five groups，10 rats in each group. The smoked molding method establishment of pulmonary Qi deficiency syndrome in a rat model， modeling at the same time intragastric administration of Dongyuan Yiqi ointment and paste， for 60 days，using immunohistochemical staining method for detection of SABC in pulmonary tissue of MMP-2 and MMP-9 expression. Results Compared with the control group， model group， MMP-9， MMP-2 in bronchopulmonary tissue is highly expressed in （P<0.01）， high dose group， and Yupingfeng group MMP-9， MMP-2 expression decreased significantly （P<0.01）， wherein the high dose group is better than that of Yupingfeng group （P<0.01）. Conclusion The MMP-9， MMP-2 expression in pulmonary tissue can be inhibited by Dongyuan Yiqi ointment， to a certain extent， prevent formation of lung-qi deficiency syndrome model.

[Key words] Dongyuan Yiqi ointment； Lung-qi deficiency syndrome； Matrix metalloproteinase

肺氣虛證是肺的衛(wèi)氣、主氣功能減退為主的全身性疾病，常反復(fù)發(fā)作。肺氣虛證在人群中的發(fā)病率很高，主要罹患人群為中老年患者和兒童，需要從根本上改善患者體質(zhì)，以預(yù)防為主，防治結(jié)合，降低肺氣虛證的罹患率和復(fù)發(fā)率。東垣益氣膏是來(lái)自李東垣的清暑益氣湯加減，經(jīng)過(guò)加工熬制的中醫(yī)傳統(tǒng)劑型，是用于防治氣虛型外感的常用方劑。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)染色鏈霉親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（SABC）方法觀察東垣益氣膏預(yù)防性給藥對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）在肺氣虛證大鼠模型支氣管和肺組織中的表達(dá)的影響。

1?資料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源

SD大鼠50只，雌雄各半，平均體質(zhì)量為（200±25）g。在山西省中醫(yī)藥研究院中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物室清潔級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（晉）2012-2。

1.2?藥物與試劑

東垣益氣膏是由山西省中醫(yī)院和平分院制成的浸膏，主要成分為：生黃芪15 g、炙甘草6 g、黨參10 g、當(dāng)歸10 g、麥冬10 g、五味子10 g、青皮10 g、陳皮10 g、神曲10 g等。玉屏風(fēng)顆粒（廣東環(huán)球制藥有限公司，批號(hào)99160）。多聚賴氨酸、一抗、光譜純?cè)噭⊿P）、二氨基聯(lián)苯胺（Dab），均購(gòu)于河北博海生物工程開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3?主要儀器設(shè)備

顯微鏡（日本奧林巴斯，BX51T-PHD-J11），多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)（美國(guó)Media Cybernetics 公司，Image-Pro Plus），切片機(jī)（德國(guó)萊卡，RM2015），離心機(jī)（北京離心機(jī)廠，LDZ5-2型）。

1.4?實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1?模型制作?大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)l周后，除對(duì)照組外，模型組采用文獻(xiàn)[1] 的方法，將大鼠分批置入特制的1 m3的煙室中， 用鋸末50 g加10支紅山茶牌香煙混合點(diǎn)燃煙熏，熏煙 30 min/次， 2次/d；自由進(jìn)食、飲水，適當(dāng)通風(fēng)，以防大鼠窒息。每天觀察并記錄其癥狀體征變化，60 d完成造模。

1.4.2?分組與給藥?將大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。（1）對(duì)照組：置于正常無(wú)煙環(huán)境中飼養(yǎng)，不予處理。（2）模型組：造模開(kāi)始時(shí)以20 mL/（kg·d）灌服無(wú)菌水1次/d。（3）陽(yáng)性對(duì)照組：造模開(kāi)始時(shí)予玉屏風(fēng)顆粒水溶劑5 g/（kg·d）。（4）東垣益氣膏低劑量組：造模開(kāi)始時(shí)予東垣益氣膏水溶劑灌胃 5 g/（kg·d），相當(dāng)于成人常規(guī)臨床用量7倍。（5）東垣益氣膏高劑量組：造模開(kāi)始時(shí)予東垣益氣膏水溶劑灌胃 10 g/（kg·d），相當(dāng)于成人常規(guī)臨床用量的14倍。

1.5?取材及觀察指標(biāo)

1.5.1?癥狀與體征?觀察各組大鼠的活動(dòng)度、對(duì)外界反應(yīng)的靈敏度、攝食、體重、毛發(fā)色澤的變化。

1.5.2?MMP-2和MMP-9表達(dá)的檢測(cè)?取每只大鼠的右肺下葉及氣管，按照免疫組織化學(xué)染色SABC方法，用磷酸鹽緩沖液沖洗、4%多聚甲醛進(jìn)行脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，將厚度5 μm的組織切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60℃過(guò)夜，脫蠟、入水。用正常山羊血清替代一抗作陰性對(duì)照。MMP-2和MMP-9的陽(yáng)性表達(dá)以光學(xué)顯微鏡下見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明確的棕黃色顆粒的細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果采用多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系（美國(guó)Media Cybernetics公司）對(duì)MMP-2和 MMP-9的表達(dá)進(jìn)行圖像分析，表達(dá)結(jié)果用陽(yáng)性面積和平均光密度表示。

1.6?統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用（）表示， 各組間比較用t 檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?癥狀與體征

對(duì)照組活潑好動(dòng)，體形肥胖，毛發(fā)光澤，呼吸平穩(wěn)。模型組大鼠先后出現(xiàn)精神萎靡， 行動(dòng)遲緩； 體重增幅減小，食量減少；毛發(fā)色黃、無(wú)光澤易脫落；呼吸加深急促，咳嗽頻作，偶有呼吸道分泌物流出。給藥組表現(xiàn)介于空白組、模型組之間。

2.2?MMP-2在支氣管、肺組織中的表達(dá)

對(duì)照組大鼠支氣管和肺組織中MMP-2少量陽(yáng)性表達(dá)（圖1），模型組支氣管和肺組織MMP-2陽(yáng)性表達(dá)明顯多于對(duì)照組（圖2），玉屏風(fēng)組、東垣益氣膏高劑量組支氣管和肺組織MMP-2陽(yáng)性表達(dá)減少（圖3～5）。陰性對(duì)照組大鼠支氣管、肺組織中MMP-2不表達(dá)。其中東垣益氣膏高劑量組優(yōu)于玉屏風(fēng)組。各組大鼠支氣管、肺組織中MMP-2的平均光密度和陽(yáng)性面積見(jiàn)表1。

2.3?MMP-9在支氣管、肺組織中的表達(dá)

對(duì)照組大鼠支氣管和肺組織中MMP-9少量陽(yáng)性表達(dá)（圖6），模型組支氣管和肺組織MMP-9達(dá)明顯多于對(duì)照組（圖7），玉屏風(fēng)組、東垣益氣膏高劑量組支氣管和肺組織MMP-9表達(dá)減少（圖8～10）。陰性對(duì)照組大鼠支氣管、肺組織中MMP-9表達(dá)。其中東垣益氣膏高劑量組優(yōu)于玉屏風(fēng)組。各組大鼠支氣管、肺組織中MMP-9 的平均光密度和陽(yáng)性面積見(jiàn)表1。

3?討論

基質(zhì)金屬蛋白酶家族是一類(lèi)活性依賴于鋅離子和鈣離子的蛋白水解酶，能降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），以酶原形式分泌，主要參與組織重建、修復(fù)等[2]。ECM 包括纖維性成分、連接蛋白和間質(zhì)成分，主要為糖胺聚糖等，對(duì)細(xì)胞增殖和分化發(fā)揮重要調(diào)控作用。合成這些蛋白質(zhì)的 ECM 代謝酶可分為基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi)（MMPs）和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物（TIMP）[3]。MMP-2和MMP-9作為基質(zhì)金屬蛋白酶中兩類(lèi)具有基質(zhì)分解活性的酶類(lèi)，主要水解變性膠原及基膜的主要成分IV型膠原。在正常情況下，構(gòu)成肺泡壁的ECM的降解與合成處于動(dòng)態(tài)平衡，以保持正常的肺組織結(jié)構(gòu)和肺功能，蛋白酶分泌增加和/或抗蛋白酶減少均可致ECM 受損[4]。正常肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶主要參與肺基質(zhì)的更新、損傷愈合等，從而使肺基質(zhì)能夠維持氣道和肺泡結(jié)構(gòu)的完整，以維持正常的肺功能。本實(shí)驗(yàn)造模采用煙熏法，在煙霧的不斷刺激下，呼吸道單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)被激活，使氣道中肺泡巨噬細(xì)胞（AM）、嗜中性粒細(xì)胞（PMN）等炎性細(xì)胞增加，導(dǎo)致MMP-2和MMP-9 在AM 等炎性細(xì)胞和部分肺泡上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中大量合成與分泌[5]。MMP-2和MMP-9大量產(chǎn)生產(chǎn)生和釋放后，對(duì)肺泡壁的ECM 進(jìn)行破壞，同時(shí)炎癥細(xì)胞在氣道壁、氣道腔和肺泡腔中聚集，形成惡性循環(huán)，進(jìn)一步加重了局部的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)了肺氣虛證的發(fā)生發(fā)展。

肺氣虛證為肺系病的常見(jiàn)證候，目前對(duì)于肺氣虛證的治療研究，多是患病后的治療，因本證屬虛證，易于反復(fù)發(fā)作，所以單純的治療，往往預(yù)后不理想，而且日久易變生其他疾病，因此必須重視早期積極干預(yù)和治療，未病先防。本研究中所用的清暑益氣湯是山西省中醫(yī)藥研究院已故名老中醫(yī)朱進(jìn)忠用于防治氣虛型外感的常用方劑，療效甚佳。本方源于李東垣《脾胃論》，由人參、黃芪、當(dāng)歸、白術(shù)、甘草、升麻、葛根、澤瀉、神曲、蒼術(shù)、麥冬、五味子等藥物組成。方取黨參、黃芪、白術(shù)、麥冬、五味子、甘草益氣生津，以扶元?dú)?；黃柏、蒼術(shù)、神曲清熱燥濕、消食導(dǎo)滯，以祛病邪；升麻、葛根、澤瀉以升清降濁；當(dāng)歸、青陳皮以調(diào)暢氣血；生姜、大棗以調(diào)和管衛(wèi)。聚益氣升陽(yáng)、清熱生津、斂陰止汗、健脾燥濕、理氣和胃之功效于一體[6]。膏方作為祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分之一， 最大的優(yōu)勢(shì)是根據(jù)中醫(yī)的基本理論，運(yùn)用“治未病”的理念，通過(guò)“固本、治本”全面防范疾病發(fā)生，提高生存質(zhì)量[7]。用于臨床兼顧面廣，口感好，不傷脾胃，適宜久服，簡(jiǎn)單方便，是臨床的一種個(gè)性化的防治疾病的手段[8]，將本方制備成膏用于肺氣虛證的防治能很好地體現(xiàn) “治未病”的思想。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組MMP-2和MMP-9表達(dá)較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，提示肺氣虛證與MMP-2和MMP-9 的表達(dá)增加有關(guān)。玉屏風(fēng)組、東垣益氣膏高劑量組MMP-2 和MMP-9表達(dá)較模型組明顯減少，其中高劑量組優(yōu)于玉屏風(fēng)組。提示東垣益氣膏預(yù)防性給藥能明顯抑制肺氣虛證大鼠MMP-2和MMP-9的表達(dá)，干預(yù)氣道重構(gòu)，在一定程度上阻止肺氣虛證模型的形成。這可能是東垣益氣膏能有效地干擾“肺氣虛證”模型形成的機(jī)制之一。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 王元?jiǎng)?，張敏華，蔡圣榮，等.肺氣虛證動(dòng)物模型的制備[J].中國(guó)病理生理雜志，1994，10（1）：15.

[2] 張小梅，吳建軍，姜良鐸，等.安肺益腎方對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠模型肺氣道重建的影響[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2009，2，（3）：179-181.

[3] 趙敏，陳忻怕，陳振發(fā).清肺化痰通絡(luò)方對(duì)肺纖維化大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9（15）：14-16.

[4] 羅慰慈.現(xiàn)代呼吸病學(xué)[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，1997：119.

[5] 劉向國(guó)，方志斌，蔡圣榮，等.肺氣虛證模型大鼠肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的變化[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2006，13（5）：289-291.

[6] 柯聯(lián)才.東垣清暑益氣湯探微[J].中國(guó)中醫(yī)藥報(bào)，2005，8（6）：1-2.

[7] 胡蘭貴.中醫(yī)治未病與中藥膏方[J].中醫(yī)腸療特色療法研討會(huì)論文集，2011：44-47.

[8] 王珺，張婉，陳浩林，等.探討傳統(tǒng)膏方在 “治未病”中的臨床體現(xiàn)[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009，20（12）：3100-3101.

（收稿日期：2012-08-09）