李靖靖 郭 林

（中州大學化工食品學院，河南 鄭州 450044）

免疫法檢測瘦肉精的現(xiàn)狀及其發(fā)展

李靖靖 郭 林

（中州大學化工食品學院，河南 鄭州 450044）

免疫檢測特異性好、分析速度快、成本低，在瘦肉精檢測領域具有重要的應用價值。文章介紹膠體金免疫層析技術、酶聯(lián)免疫吸附測定法及電化學、壓電生物傳感器等瘦肉精免疫檢測主要方法的反應機理、技術特點、制作方法及相關的技術進展，指出目前研究中需要解決的問題并展望未來發(fā)展方向，認為開發(fā)新一代低成本、高靈敏度、高穩(wěn)定性和高壽命的免疫傳感器是快速實時及特異性檢測瘦肉精殘留較為理想的方法和途徑。

免疫檢測；瘦肉精；殘留；檢測方法

2011年央視3·15特別節(jié)目爆出的“瘦肉精”事件，再次引起中國國民對食品安全問題的關注。雙匯集團的“十八道檢驗、十八個放心”唯獨沒有瘦肉精的檢測，引起人們對瘦肉精檢測方法進行深層次的思考。瘦肉精（clenbnterol bydrochloride or leanness enhancer）是鹽酸克倫特羅（clenbuterol）、萊克多巴胺（ractopamine）、硫酸沙丁胺醇（salbutamol）、特布他林（terbutaline）和氨茶堿（aminophylline）類等具有增加瘦肉產(chǎn)率的作用的化學藥品。這些在動物體內(nèi)殘留的“瘦肉精”通過食物進入人體，在人體積蓄中毒，會出現(xiàn)異常生理反應的中毒現(xiàn)象［1］。瘦肉精的殘留已成為重大食品安全問題，因而，中國和歐盟嚴令禁止包括鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺在內(nèi)的β－2腎上腺素能興奮劑（β－2－adrenoceptor agonist）在動物生產(chǎn)中的應用。但是，目前非法濫用瘦肉精的情況依然嚴重。造成這種屢禁不止現(xiàn)象的原因：利益驅使某些商販鋌而走險；動物性食品的安全監(jiān)督、檢測機制不完善、不健全，或保障不得力；檢測方法、手段不完善、不得力，達不到準確、方便、快速、經(jīng)濟的目標。

目前，國內(nèi)外實驗室檢測瘦肉精殘留最常用的方法是氣相色譜－質(zhì)譜法（GC－MS）［2，3］、高效液相色譜／質(zhì)譜法（HPLC／MS）［4－7］、電 化 學［8－10］、毛 細 管 電 泳［11－13］、分 子 印跡［14，15］和免疫 分 析 技 術［16］。 而 免 疫 分 析 技 術 （immunoassays，IA）以其設備簡單、操作簡便、檢測費用低而得到快速的發(fā)展和廣泛的應用，網(wǎng)上熱賣的“瘦肉精快速檢測卡”更使免疫分析技術成為關注的熱點，但是不科學不嚴謹?shù)男麄饔挚赡軐е孪M者的誤讀誤用。文章就瘦肉精免疫檢測的主要方法的反應機理、技術特點、制作方法及相關的技術進展作簡要介紹。

1 膠體金免疫層析技術

膠體金免疫層析技術（colloidal gold immunochromatography assay，GICA）是由Osikowicz等［16］于1990年建立的一種新型快速、簡便的檢測方法，它以其不需要特殊設備和復雜操作過程的特點而得到迅速發(fā)展［17］。

1.1 基本原理

將膠體金標記的抗體或單克隆抗體的膠體金檢測試劑沉淀到硝酸纖維素薄膜上制成標記墊（膠金墊），當含有目標檢測物的待測樣品（如尿液、血漿或全血等）加到膠金墊上，檢測試劑被溶解并與待檢樣品一起沿薄膜條移動，樣品中的待檢物與檢測試劑生成的結合物，在樣品移動至固定有捕獲試劑的區(qū)域時，產(chǎn)生特異性競爭結合而被截留，聚集在檢測帶上，通過肉眼觀察到顯色結果［18］。

1.2 技術關鍵

膠體金標記的單克隆抗體的制備：將瘦肉精中的鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺等沒有抗原性的小分子物質(zhì)（半抗原）與蛋白質(zhì)等大分子載體共價結合所制成的單克隆抗體［19］與平均直徑約為15nm的膠體金，通過正負間的靜電吸附形成牢固的結合。將這個膠體金標記的單克隆抗體滴加在玻璃纖維膜上，干燥后可得膠金墊（conjugate pad）。

1.3 試紙卡（條）的組裝方法

在塑料基板上，依次粘貼濾紙、樣本墊、檢測試劑墊（膠金墊）、硝酸纖維素膜和吸水墊，在兩端粘上有顏色的覆蓋膜，用BioDot裁切機切割成一定尺度的試紙條，裝入檢測卡中，再裝入一袋干燥劑，熱封口，4℃保存，試紙條組裝流程示意見圖1。

圖1 試紙條組裝示意圖Figure 1 Schematic diagram of a test strip showing the components

1.4 產(chǎn)品特點

優(yōu)點：操作簡單、檢測速度快，一般只需10～15min；無需其他儀器設備；樣本量需求少；適用于大量樣本的快速初步篩；檢測費用低，一般10～20元／樣本。

缺點：有時出現(xiàn)假陽性結果。

建議：出現(xiàn)陽性結果，應復檢并用附帶的瘦肉精陽性對照液作陽性對照試驗，必要時可用GC／MS作定量檢測。

2 酶聯(lián)免疫吸附測定法

酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）是在免疫酶技術（immunoenzymatic techniques）的基礎上發(fā)展起來的一種新型的免疫檢測技術，是一種特殊的試劑分析方法。

2.1 基本原理

以酶或輔酶為標記物標記抗原或抗體，在合適的載體上，與相應的抗體或抗原進行特異性吸附，形成抗體抗原復合物，用酶促反應的放大作用來顯示初級免疫學反應，常見的EUISA類型有：雙抗夾心、間接法和競爭法［20］。ELISA流程示意見圖2。

2.2 技術關鍵

（1）瘦肉精單克隆抗體的制備。

（2）在固定相上包被瘦肉精單克隆抗體。

（3）酶標記的抗原。

（4）酶作用的底物。

圖2 間接ELISA流程圖Figure 2 Flow diagram of the enzyme－linked immunosorbent assay

2.3 操作過程

（1）加100μL稀釋后的抗體到每個微孔底部，蓋上蓋板膜（避光），在8 ℃孵育過夜［21］。

（2）洗滌后，在各自的微孔中，分別加入100μL稀釋后的酶標記物、20μL的標準液或處理好的樣品液，在室溫孵育1h。

（3）洗滌后，迅速加入50μL基質(zhì)及50μL發(fā)色劑到微孔中，在室溫暗處孵育30min。

（4）加100μL反應終止液到每個微孔中終止反應，混合后在450nm處測量吸光度值。

2.4 產(chǎn)品特點

優(yōu)點：操作簡單，無需其他儀器設備；樣本量需求少；適用于樣本的篩選；

缺點：有時出現(xiàn)假陽性結果；萊克多巴胺檢測需將樣品酶解還原后再進行檢測，酶解過程需要較長的時間，每次分析至少需要3h，不利于快速檢測；需要標記二抗。

3 生物傳感器技術

生物傳感器（biosensor，BS）是一種由生物識別元件和信號轉換、放大元件共同構成的對生物物質(zhì)敏感并將濃度轉換為電信號進行檢測的儀器。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，生物傳感器分析技術具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、能在線檢測等優(yōu)點，已經(jīng)成為食品安全檢測的重要手段 ［22，23］。

Zhu等［24］報道了一種應用競爭性表面增強拉曼散射（SERS）檢測克倫特羅的免疫檢測方法。該方法首先是將4，4′－聯(lián)吡啶和待測樣品和克倫特羅抗體分別結合在SERS納米探針上，通過待測樣品中的抗原和固定在基底上的抗原－BSA偶聯(lián)物與結合在SERS納米探針上的抗體競爭反應對克倫特羅進行定量檢測的。該方法檢測區(qū)間寬（0.1～100pg／mL）和較低的檢出限量（0.1pg／mL）。Ji等［25］報道了一種基于 HRP（horseradish peroxidase）催化Luminol－H2O2化學發(fā)光反應，以對碘苯酚（4－iodophenol PIP）為增敏劑，通過待測樣品中的抗原和抗原－HRP偶聯(lián)物與結合在SERS納米探針上的抗體競爭反應對克倫特羅進行競爭性毛細管電泳免疫化學發(fā)光定量檢測的，檢出限量1.2nmol／L。Lu等［26］報道了通過固定有萊克多巴胺衍生物的SPR－2004生物傳感器芯片，檢測生豬中萊克多巴胺殘留的表面等離子共振（surface plasmon resonance，SPR）生物傳感器抑制免疫殘留檢測方法。檢出限為0.6μg／kg，平均回收率為80%，相對標準偏差低于10%。這種方法簡單快速，檢測時間為5min，與ELISA方法比較，抗體無需標記。在相同的前處理條件下，與UPLC－MS／MS相比，回收率和精密度都較好，并且受樣品基質(zhì)的影響小，特別適合大量樣品的快速篩選。Liu等［27］報道了以固定了萊克多巴胺－卵清白蛋白偶聯(lián)物的SPR芯片為生物傳感器，采用間接競爭法，測定生豬樣品中萊克多巴胺的殘留量，最低檢出限為0.12ng／mL，線性范圍為4.29～28ng／mL，IC50為1.17ng／mL。Traynor等［28］提出了表面等離子共振（SPR）免疫傳感器應用于多種β－2腎上腺素能激動劑（β－agonists）殘留快速檢測，檢測16個活體樣品中的多種β－2腎上腺素能激動劑僅需1.5d，檢出限量對于鹽酸克倫特羅可達0.11ng／g，沙丁胺醇（salbutamol）達0.19ng／g，對于其他可達1.5ng／g以下。呂會田等［29］基于量子點標記的ATP合酶分子馬達免疫旋轉生物傳感器（immuno－rotary biosensor，IRB），結合熒光技術，利用 BPCL弱光檢測器實現(xiàn)了對鹽酸克倫特羅快速、高靈敏度的檢測，其感應靈敏度可達10－12g／L。肖紅玉等［30］將抗體和辣根過氧化物酶包被到空白載體膜上制成的抗體膜固定到Nafion－二茂鐵修飾玻碳電極，進行循環(huán)伏安掃描，實現(xiàn)快速（20min內(nèi)）、準確（準確度達97%）和低成本地檢測克倫特羅。線性范圍為0.1～8.1μg／L，檢出限為0.1μg／L。王秀玲［31］利用熒光CdSe／CdS量子點標記的克倫特羅抗原（抗原－QDs）和待測克倫特羅抗原同時免疫競爭核／殼型金磁珠Fe3O4／Au－克倫特羅抗體偶聯(lián)物上，磁性分離后，通過檢測清液中未與抗體相連的抗原－QDs熒光強度對豬肉中的克倫特羅，最低檢出限為0.50pg／mL，線性范圍是0.50～20 000ng／mL。黃淵等［32］利用微懸臂梁傳感對瘦肉精進行非標記檢測，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)能夠檢測至少1μg／L濃度的瘦肉精標準樣品，而且具有很強的選擇性，在對照試驗中加入不含瘦肉精的1mg／L氯霉素溶液沒有響應。另外，瘦肉精抗原抗體的結合導致微懸臂梁產(chǎn)生壓應力，而且微懸臂梁表面應力的改變與樣品濃度的對數(shù)成線性關系。M.A.Cooper等［33］綜述了2001～2005年間關于應用于生物分子間相互作用分析的石英晶體微天平生物傳感器的文獻。

免疫傳感器方法具有簡單、方便、快捷等優(yōu)點，近年來，生物傳感器研究已成為熱點，但仍存在以下不足：特異性抗體或抗原的選擇與制備難度大，研發(fā)成本高；感受器，或分子識別物采用的固定方法操作繁雜，實施成本高；檢測的平行性較差，重復性不高，有時還會出現(xiàn)假陰（陽）性；處于實驗室階段，尚未有實用化的產(chǎn)品，無法現(xiàn)場檢測。同時由于生物活性材料生存條件有限，長期以來生物傳感器壽命、穩(wěn)定性及制備的復雜性制約著研究成果商品化與批量生產(chǎn)［34］。筆者認為未來生物傳感器的發(fā)展趨勢和重點方向是微型化、多功能化、智能化和集成化，而特異性生物活性材料的選擇、制備和固定化是免疫傳感器制備的關鍵步驟。開發(fā)新一代低成本、高靈敏度、高穩(wěn)定性和高壽命的免疫傳感器是檢測瘦肉精殘留較為理想的方法和途徑，也是今后的發(fā)展趨勢。

1 Brambilla G，Angeletti R，Traldi P.Clinical and pharmacological profile in a clenbuterol epidemic poisoning of contaminated meat in Italy［J］.Toxicology Letters，2000（114）：47～53.

2 He L，Su Y，Zeng Z，et al.Determination of ractopamine and clenbuterol in feeds by gas chromatography－mass spectrometry［J］.Animal Feed Science and Technology，2007（132）：316～323.

3 Amendola L，Colamonici C，Rossi F，et al.Determination of clenbuterol in human urine by GC－MS－MS－MS：confirmation analysis in antidoping control［J］.Journal of Chromatography B，2002（773）：7～16.

4 Zhang X Z，Gan Y R，Zhao F N.Determination of clenbuterol in pig liver by high－performance liquid chromatography with a coulometric electrode array system［J］.Analytica Chimica Acta，2003（489）：95～101.

5 Liu B，Yana H，Qiao F，et al.Determination of clenbuterol in porcine tissues using solid－phase extraction combined with ultrasound－assisted dispersive liquid－liquid microextraction and HPLC－UV detection［J］.Journal of Chromatography B，2011（879）：90～94.

6 Song Y，Wang D，Hu Y，et al.Direct separation and quantitative determination of clenbuterol enantiomers by high performance liquid chromatography using an amide type chiral stationary phase［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2003（31）：311～319.

7 Chen X B，Wu Y L，Yang T.Simultaneous determination of clenbuterol，chloramphenicol and diethylstilbestrol in bovine milk by isotope dilution ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography B，2011（879）：799～803.

8 Yuen Ada H Y，Yacoub M H，Smolenski R T.Determination of clenbuterol concentration in human blood using liquid chromatog－raphy with electrospray／ion－trap tandem mass spectrometry［J］.Rapid Commun.Mass Spectrom，2005（19）：3 603～3 606.

9 Liu L，Pan H，Dua M，Xie W，et al.Glassy carbon electrode modified with Nafion－Au colloids for clenbuterol Electroanalysis［J］.Electrochimica Acta，2010（55）：7 240～7 245.

10 Jin G P，Peng X，Ding Y F.The electrochemical modification of clenbuterol for biosensors of dopamine，norepinephrine，adrenalin，ascorbic acid and uric acid at paraffin－impregnated graphite electrode［J］.Biosensors and Bioelectronics，2008（24）：1 031～1 035.

11 Zhou J，Xu X，Wang Y.Competitive immunoassay for clenbuterol using capillary electrophoresis with laser－induced fluorescence detection［J］.Journal of Chromatography B，2007（848）：226～231.

12 Chen Q，F(xiàn)an L.Y，Zhang W，et al.Separation and determination of abused drugs clenbuterol and salbutamol from complex extractants in swine feed by capillary zone electrophoresis with simple pretreatment［J］.Talanta，2008（76）：282～287.

13 Sirichai S，Khanatharana P.Rapid analysis of clenbuterol，salbutamol，procaterol，and fenoterol in pharmaceuticals and human urine by capillary electrophoresis［J］.Talanta，2008（76）：1 194～1 198.

14 Zhao C，Jin G P，Chen L L，et al.Preparation of molecular imprinted film based on chitosan／nafion／nano－silver／poly quercetin for clenbuterol sensing［J］.Food Chemistry，2011（129）：595～600.

15 Andea P，Miroslav S，Silvia S，et al.A solid binding matrix／molecularly imprinted polymer－based sensor system for the determination of clenbuterol in bovine liver using differential－pulse voltammetery［J］.Sensors and Actuator B，2001（76）：286～294.

16 Osikowicz G，Beggs M，Brookhart P，et al.One－step chromatographic immunoassay for qualitative determination of choriogonadotropin in urine［J］.Clin.Chem.，1990（36）：1 586.

17 Peng D，Hu S，Hua Y，et al.Comparison of a new gold－immunochromatographic assay for the detection of antibodies against avian influenza virus with hemagglutination inhibition and agar gel immunodiffusion assays［J］.Vet.Immunol.Immunopathol，2007（117）：17～25.

18 Zhang G P，Wang X N，Yang J F，et al.Development of an immunochromatographic lateral flow test strip for detection ofβadrenergic agonist Clenbuterol residues［J］.Journal of Immunological Methods，2006（312）：27～33.

19 Wang X.N，Zhou J.Y，Yang Y.Y，et al.Generation and characterization of monoclonal antibody for theβ－adrenergic agonist clenbuterol［J］.Chin.J.Immunol，2004，20（3）：194～198.

20 金晶.ELISA法和膠體金免疫層析法檢測豬尿樣中的萊克多巴胺［D］.南昌：南昌大學，2007.

21 Posyniak A，Zmudzki J，Niedzielska J.Screening procedures for clenbuterol residue determination in bovine urine and liver matrices using enzyme－linked immunosorbent assay and liquid chromatography［J］.Analytica Chimica Acta.，2003（483）：61～67.

22 Alocilja E C，Radke S M.Market analysis of biosensors for food safety［J］.Biosens Bioelectron，2008（18）：841～846.

23 Terry L A，White S F，Tigwell L J.The application of biosensors to fresh produce and the wider food industry［J］.J.Agric Food Chem.，2005（53）：1 309～1 316.

24 Zhu G C，Hu Y J，Gao J，et al.Highly sensitive detection of clenbuterol using competitive surface－enhanced Raman scattering immunoassay［J］.Analytica Chimica Acta.，2011（697）：61～66.

25 Ji X，He Z，Ai X，et al.Determination of clenbuterol by capillary electrophoresis immunoassay with chemiluminescence detection［J］.Talanta，2006（70）：353～357.

26 Lu X，Zheng H，Li X Q，et al.Detection of ractopamine residues in pork by surface Plasmon resonance－based biosensor inhibition immunoassay ［J］. Food Chemistry，2012 （130）：1 061～1 065.

27 Liu M，Ning B，Qu L，et al.Development of indirect competitive immunoassay for highly sensitive determination of ractopamine in pork liver samples based on surface plasmon resonance sensor［J］.Sensors and Actuators B，2012（161）：124～130.

28 Traynor I M，Crooks S R H，Bowers J，et al.Detection of multi－β－agonist residues in liver matrix by use of a surface plasma resonance biosensor［J］.Analytica Chimica Acta.，2003（483）：187～191.

29 呂會田，張云，樂加昌，等.旋轉生物傳感器高靈敏檢測鹽酸克倫特羅方法研究［J］.食品科學，2007，28（8）：446～450.

30 肖紅玉，柴春彥，劉國艷，等.檢測克倫特羅的免疫生物傳感器的研制［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2006，16（1）：1～3.

31 王秀玲，量子點和納米金的合成及其在免疫分析中的應用［D］.蘇州：蘇州大學，2010.

32 黃淵，薛長國，張青川，等.利用微懸臂梁傳感對瘦肉精進行非標記檢測［J］.醫(yī)用生物力學，2009，24（2）：89～93.

33 Cooper M A，Singleton V T.A survey of the 2001to 2005 quartz crystal microbalance biosensor literature：applications of acoustic physics to the analysis of biomolecular interactions［J］.J.Mol.Recognit，2007（20）：154～184.

34 蔣雪松，王劍平，應義斌，等.用于食品安全檢測的生物傳感器的研究進展［J］.農(nóng)業(yè)工程學報，2007，23（5）：272～277.

Advances and status in clenbnterol hydrochloride by immunosorbent assay

LI Jing－jing GUO Lin

（College of Chemical and Food Engineering，Zhongzhou University，Zhengzhou，Henan450044，China）

Immunosorbent Assay（IA）because of its specificity，fast response，low cost，plays an important role in the clenbnterol hydrochloride detection.This paper is presented as an overview of applications of colloidal gold immunochromatography，enzyme－linked immunosorbent assay and electrochemical，piezoelectric biosensors.The review includes the principle，characteristic，and manufacture of IA.Factors limiting the practical application of IA to analytical problems are also presented.This report assesses future directions for IA of clenbnterol hydrochloride and the following future trends are suggested：more sensitive detection，miniaturization，cheap，convenient，and increased functionality of surface treatments.The technique offers great potential to meet the need for rapid and specific real－time detection for clenbnterol hydrochloride.

immunosorbent assay；clenbnterol bydrochloride；residual；determination method

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.03.072

李靖靖（1962－），女，中州大學教授。E－mail：zhongzhoudaxue＠sina.com

2012－02－15