何亞斌

（農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，上海 200436）

UPLC－MS－MS法測(cè)定水產(chǎn)品中克百威及其代謝物

何亞斌

（農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，上海 200436）

采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中克百威及其代謝物（3－羥基克百威、3－酮基克百威和呋喃酚）含量的方法。樣品經(jīng)乙腈提取，正己烷脫脂，HLB固相萃取柱凈化，色譜柱分離，電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)分析，并對(duì)液質(zhì)分離條件及參數(shù)和樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，克百威及其代謝物在0.08～100ng/mL范圍內(nèi)線性良好（0.998 3～0.999 7）。在0.25～2.5μg/kg時(shí)，平均加標(biāo)回收率在87.9%～96.1%，RSD值在1.4%～9.5%。該方法測(cè)定克百威、3－羥基克百威、3－酮基克百威和呋喃酚的檢出限均為0.25μg/kg。該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏，可用于水產(chǎn)品中克百威及其代謝物殘留量的測(cè)定。

超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜；水產(chǎn)品；克百威；3－羥基克百威；3－酮基克百威；呋喃酚

克百威是一種廣譜內(nèi)吸殺蟲殺螨劑，可用于多種作物防治土壤內(nèi)及地面上的300多種害蟲和線蟲［1，2］?？税偻?duì)膽堿酯酶抑制的不可逆性決定了其對(duì)人、畜、禽、魚等的毒性極高［3－5］，目前，克百威在種植業(yè)中已經(jīng)禁止使用。但是克百威在土壤中的殘留期較長(zhǎng)，在土壤中的移動(dòng)性能較大（水溶解度為700mg/L），在降水量大、地下水位淺的砂土地區(qū)易引起對(duì)地下水的污染［6］。同時(shí)，魚體對(duì)呋喃丹具有一定的富集，而且殘留濃度較高［7］。目前在中國(guó)農(nóng)業(yè)部第235號(hào)公告中規(guī)定動(dòng)物性食品中不得檢出克百威。在GB 11607——1989中規(guī)定克百威的標(biāo)準(zhǔn)值要≤0.01mg/L，但是在中國(guó)缺乏水產(chǎn)品中克百威的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)?？税偻趬A性介質(zhì)下分解較快，可降解為3－羥基克百威、3－酮基克百威，最終降解成相應(yīng)的酚類［8］。因此，測(cè)定克百威的殘留量，除測(cè)定克百威含量外，還需測(cè)定3－羥基克百威、3－酮基克百威和呋喃酚等代謝物。

目前報(bào)道的關(guān)于測(cè)定克百威的方法很多［9－11］，但未見同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中克百威及其多種代謝物的報(bào)道。本試驗(yàn)擬采用UPLC－MS－MS法，建立同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中克百威及其代謝物（3－羥基克百威、3－酮基克百威、呋喃酚）的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水產(chǎn)品：魚、蝦，購(gòu)自上海曹安農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；

乙腈、甲酸和正己烷：色譜純，美國(guó)Sigma公司；

氯化鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

標(biāo)準(zhǔn)品：克百威、3－羥基克百威、3－酮基克百威、呋喃酚，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；

Oasis HLB固相萃取柱：60mg/3mL，美國(guó)沃特世公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜系統(tǒng)：ACQUITY UPLC，美國(guó)沃特世公司；

串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源（ESI）及 Masslynx 4.0數(shù)據(jù)工作站）：Waters XEVO TQ，美國(guó)沃特世公司；

離心機(jī)：Heraeus Multifuge X1R，美國(guó)熱電公司；

氮吹儀：ANPEL DC12，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；

超聲波提取儀：EDAA－2500TH，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；

固相萃取裝置：SBAB－57030U，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取 取500g代表性水產(chǎn)品樣品可食性部分，粉碎均勻，冷凍保存。準(zhǔn)確稱取5.00g樣品，于50mL離心管中，加入3～5g氯化鈉，加入乙腈15mL，均質(zhì)2min，4℃，5 000r/min離心5min，取上清液于50mL離心管中。再用15mL乙腈分兩次重復(fù)以上步驟提取殘?jiān)?，合并上清液。在提取液中加?0mL乙腈飽和過的正己烷，劇烈振蕩，于4℃，5 000r/min離心3min，棄去正己烷相，再用10mL乙腈飽和過的正己烷，重復(fù)以上步驟。有機(jī)相轉(zhuǎn)入雞心瓶中，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸干。加入30%乙腈水溶液1.0mL溶解殘?jiān)?，再加?.0mL蒸餾水，混合均勻，供SPE柱凈化。

1.3.2 凈化 將全部樣品提取液過Oasis HLB SPE柱 （預(yù)先用3mL甲醇、3mL水活化），上樣后再用6mL水淋洗，淋洗后在固相萃取裝置上真空抽干水分10min，經(jīng)6mL甲醇溶液洗脫，收集至10mL玻璃試管中，50℃氮?dú)獯抵两?，加?mL流動(dòng)相，充分旋渦混合，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，待UPLC－MS－MS分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY HSS T3（1.8μm，2.1mm ×100mm），流動(dòng)相：乙腈（0.1%甲酸）－5mmol/L乙酸銨水溶液（0.1%甲酸），梯度洗脫程序見表1。流速0.3mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量5μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM，毛細(xì)管電壓1.5kV，離子源溫度150℃，霧化溫度400℃，霧化氣流速800L/h，二級(jí)碰撞氣為氬氣，碰撞氣流速0.15mL/min，其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 主要參考質(zhì)譜參數(shù)ńTable 2 MS/MS parameters

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的選擇

乙腈作為一種通用的提取溶劑在殘留檢測(cè)方面得到廣泛的應(yīng)用，由于其對(duì)脂肪、蛋白質(zhì)類化合物較難提取，對(duì)絕大多數(shù)農(nóng)藥有較高的回收率。因此，本試驗(yàn)采用乙腈作為提取試劑，再使用乙腈飽和的正己烷去除脂肪，在盡量少地帶入脂肪、蛋白類化合物的前提下，最大限度的提取了水產(chǎn)品中克百威及其代謝物。

2.2 凈化條件的選擇

本試驗(yàn)分別考察了HLB、C18兩種填料的固相萃取小柱的凈化效果。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，克百威及其代謝物在HLB、C18小柱具有一定的保留，通過水直接淋洗去除有機(jī)酸等水溶性雜質(zhì)，再用甲醇洗脫目標(biāo)化合物。HLB小柱對(duì)克百威及其代謝物柱效回收率都大于95%，但C18小柱對(duì)3－羥基克百威的保留效果不好，柱效回收率都只有60%左右。因此，采用HLB小柱凈化。

HLB小柱對(duì)克百威、3－酮基克百威和呋喃酚有很好的保留，但是，3－羥基克百威在HLB小柱上的保留比較弱。試驗(yàn)結(jié)果表明：50%的乙腈水溶液不會(huì)將吸附在HLB小柱上的克百威、3－酮基克百威和呋喃酚被洗脫下來，乙腈含量達(dá)到90%以上才能逐步洗脫下來；5mL 10%乙腈水溶液洗脫就可以將吸附在HLB小柱上的3－羥基克百威洗脫68%，而即使10mL 3%乙腈水溶液淋洗也不會(huì)將3－羥基克百威洗脫下來。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)30%乙腈水溶液能全部溶解殘?jiān)械?種化合物。因此，本方法中在乙腈提取濃縮后，用1.0mL 30%乙腈水溶液溶解殘?jiān)偌尤?.0mL純水稀釋之后上凈化柱。

2.3 儀器分析條件的選擇

本試驗(yàn)采用乙腈（0.1%甲酸）－5mmol/L乙酸銨水溶液（0.1%甲酸）作為流動(dòng)相；流動(dòng)相中加入0.1%甲酸增加了目標(biāo)化合物在噴霧前的離子化程度，提高了檢測(cè)的靈敏度；同時(shí)加入5mmoL乙酸銨，改善了目標(biāo)化合物的峰形，離子流圖見圖1～4。本試驗(yàn)采用HSS T3色譜柱，利用其對(duì)極性化合物強(qiáng)保留的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)克百威、3－羥基克百威、3－酮基克百威和呋喃酚的同時(shí)測(cè)定。在本試驗(yàn)采用的流動(dòng)相、色譜柱和洗脫比例條件下，克百威和呋喃酚未能有效分離，但由于本試驗(yàn)采用多反應(yīng)檢測(cè)的掃描方式，對(duì)目標(biāo)化合物的定性和定量都不影響。

圖1 3－羥基克百威標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)選擇離子流圖Figure 1 Selected ion chromatograms of 3－h(huán)ydroxy carbofuran

圖2 3－酮基克百威標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)選擇離子流圖Figure 2 Selected ion chromatograms of 3－keto carbofuran

圖3 克百威標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)選擇離子流圖Figure 3 Selected ion chromatograms of carbofuran

圖4 呋喃酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)選擇離子流圖Figure 4 Selected ion chromatograms of carbofuran phenol

將克百威、3－羥基克百威、3－酮基克百威和呋喃酚標(biāo)準(zhǔn)品溶液采用流動(dòng)注射直接進(jìn)樣，通過全掃描確定化合物母離子，各化合物均選用［M＋H］＋作為母離子，再對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到碎片離子，通過優(yōu)化條件，得到二級(jí)質(zhì)譜圖。通過多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM）選擇相對(duì)豐度較高的離子對(duì)，確定為定性定量離子對(duì)，并優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞電壓等參數(shù)，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表2。

2.4 線性及靈敏度

以空白樣品基質(zhì)配制一系列不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（0.08，0.16，0.80，4.00，20.00，50.00，100.00ng/mL），并依次進(jìn)樣，分別以克百威、3－羥基克百威、3－酮基克百威和呋喃酚的峰面積y為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的濃度值x為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，這4種化合物在0.08～100ng/mL范圍內(nèi)其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r大于0.998，見表3。

表3 克百威、3－羥基克百威、3－酮基克百威和呋喃酚的線性方程及相關(guān)系Table 3 Linear equations and correlation coefficients of four target compounds

在水產(chǎn)品樣品中添加最低檢出限相當(dāng)濃度的一系列濃度的標(biāo)樣，由基質(zhì)空白所產(chǎn)生的儀器背景信號(hào)的3倍值的相應(yīng)量來驗(yàn)證方法的靈敏度?？税偻?、3－羥基克百威、3－酮基克百威和呋喃酚的最低檢測(cè)限（LOD）為0.25μg/kg。

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在5.00g陰性樣品中進(jìn)行3個(gè)不同水平（0.25，0.50，2.50μg/kg）的添加回收試驗(yàn)，測(cè)定后得到克百威、3－羥基克百威、3－酮基克百威和呋喃酚的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見表4。由表4可知，在魚肉和蝦仁樣品中3個(gè)添加水平上，4種化合物的平均回收率在87.9%～96.1%，RSD 在1.4%～9.5%，符合農(nóng)藥多殘留檢測(cè)的要求［12］。

表4 魚肉、蝦仁中克百威、3－羥基克百威、3－酮基克百威和呋喃酚的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Spiked recoveries and RSDs of four target compounds in fish and shrimp（n＝ 6）

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了水產(chǎn)品中克百威及其代謝物的超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS－MS）檢測(cè)方法。采用乙腈提取，正己烷去除脂肪，HLB固相萃取小柱凈化，消除了水產(chǎn)品中蛋白、有機(jī)酸及脂類物質(zhì)的干擾，再應(yīng)用ACQUITY HSS T3色譜柱分離，電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）分析行色譜分離，實(shí)現(xiàn)了對(duì)克百威及其代謝物定性、定量測(cè)定。該檢測(cè)方法快速、靈敏、可靠。

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Determination of carbofuran and its metabolites in aquatic products by UPLC－MS－MS

HE Ya－bin

（Food Quality Supervision and Inspection Center of China Ministry of Agriculture，Shanghai200436，China）

An ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometric method（UPLC－MS/MS）has been developed for the simultaneous determination of carbofuran and its main metabolites（3－h(huán)ydroxycarbofuran，3－ketocarbofuran and carbofuran phenol）in aquatic products.The carbofuran and its main metabolites were extracted with acetonitrile，cleaned up with HLB solid phase extraction cartridge（SPE）.The UPLC analyses were performed on an ACQUITY HSS T3column with gradient evaluation，combined with electrospray ionization in positive mode（ESI＋）and multiple reaction monitoring（MRM）mode.The linear range was 0.08～100ng/mL，and the correlation coefficients were 0.998 3～0.999 7.The average recoveries of carbofuran and its main metabolites in fish and shrimp（0.25to 2.5μg/kg）ranged from 87.9%to 96.1%and the relative standard deviations were between 1.4%and 9.5%.The detection limit of carbofuran，3－h(huán)ydroxy carbofuran，3－keto carbofuran and carbofuran phenol was 0.25μg/kg.The method is easy，rapid，sensitive and suitable for the determination of carbofuran and its main metabolites in aquatic products.

Ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（UPLC－ MS－ MS）；aquatic products；carbofuran；3－h(huán)ydroxycarbofuran；3－ketocarbofuran；carbofuran phenol

10.3969 /j.issn.1003－5788.2012.04.024

上海市技術(shù)型貿(mào)易措施應(yīng)對(duì)專項(xiàng)（編號(hào)：10TBT004）

何亞斌（1980－），男，農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（上海）工程師，碩士。E－mail：heyabin＠shdenuo.com

2012－05－12