王祖翔 余 楊 孫 莉 蔣 俊

（鎮(zhèn)江出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 鎮(zhèn)江 212008）

離子色譜法測定食品中的無機(jī)銨

王祖翔 余 楊 孫 莉 蔣 俊

（鎮(zhèn)江出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 鎮(zhèn)江 212008）

建立一種離子色譜法（IC）快速測定食品中銨根離子含量。樣品用水浸泡并混勻，加入乙酸酸化，乙腈沉降蛋白，并一起通過冷凍離心去除脂肪，取適量上清液揮干后用1.0mL水復(fù)溶，過膜后備用。以H2SO4溶液梯度淋洗，淋洗液流速為1.0mL/min，采用 DIONEX IonPac CS12A色譜柱分離，帶抑制器的電導(dǎo)檢測器檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：NH＋4的線性范圍為0.1～20.0mg/L，線性相關(guān)系數(shù)R2大于0.995，檢測限（LOD）為0.05mg/kg，定量限（LOQ）為0.1 mg/kg，加標(biāo)回收率為74%～110%，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%。該方法簡便，靈敏，準(zhǔn)確，適用于多種食品中微量銨根離子的檢測。

離子色譜；非蛋白氮；銨鹽；摻假；定量檢測

蛋白質(zhì)是衡量食品營養(yǎng)價值乃至經(jīng)濟(jì)價值的一個重要指標(biāo)，而中國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的蛋白質(zhì)測定方法仍是基于凱氏定氮法，樣品中任何含氮物質(zhì)均被折算成蛋白質(zhì)含量，致使食品中非蛋白氮物質(zhì)摻假得不到有效控制。這不僅危害了人們健康，阻礙了企業(yè)生存和行業(yè)發(fā)展，更影響了中國的國際形象。無機(jī)銨鹽正是一類非蛋白氮物質(zhì)，其中含氮量高、性質(zhì)穩(wěn)定、價格低廉、應(yīng)用普遍，且少量加入不影響食品風(fēng)味的銨鹽，極有可能被非法添加到食品中。

目前，常見的銨鹽檢測方法有：比色法［1］、甲醛法［2，3］、蒸餾法（半微量定氮法）［3，4］等，但是都不同程度的存在難以準(zhǔn)確定量、受到游離酸和樣品本底色干擾嚴(yán)重和靈敏度低等問題。此外，還有報道采用分光光度法［5］和基于凱氏定氮的新方法研究［6］。離子色譜法［7－10］具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡便，穩(wěn)定性好，可同時測定多組分等優(yōu)點(diǎn)，但是很少應(yīng)用于食品中銨離子的檢測。

本試驗(yàn)擬建立相關(guān)食品中無機(jī)銨鹽（以NH＋4計）定量檢測的離子色譜檢測法，排除了常見陽離子干擾，為有效監(jiān)控食品中銨離子是否異常提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

硫酸：南京化學(xué)試劑有限公司；

Li＋（50.0mg/L）、Na＋（200.0mg/L）、NH＋4（250.0mg/L）、K＋（500.0mg/L）、Mg2＋（250.0mg/L）、Ca2＋（500.0mg/L）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：美國Dionex公司；

NH＋4標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000mg/L，美國NSI公司；

一級水：本實(shí)驗(yàn)室自制。

離子色譜配有抑制性電導(dǎo)檢測器：ICS－3000，美國Di－onex公司；

電子分析天平：AL204，瑞士Mettler Toledo公司；

優(yōu)普超純水機(jī)：UPH－IV－10T，上海優(yōu)普純水儀器設(shè)備有限公司；

氮吹儀：TurboVap LV，美國Caliper公司；

渦旋振蕩器：XW－80，上海醫(yī)大儀器廠；

超聲波清洗機(jī)：SB－1000YDTD，寧波新芝生物科技股份有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：H2050R，湖南湘儀離心機(jī)有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：DIONEX IonPac CS12A4mm×250mm；保護(hù)柱：DIONEX IonPac CG12A4mm×50mm；抑制器：DIONEX CSRS 300 4mm；淋洗液：10mmol/L H2SO4溶液；淋洗程 序：0～18min，2.5mmol/L；18.1～40min，10mmoL/L；40.1～50min；2.5mmol/L；進(jìn)樣量：25μL；流速：1.0mL/min。

1.3 銨離子和干擾離子的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

將NH＋4（1 000mg/L）標(biāo)準(zhǔn)溶液用一級水稀釋為100mg/L和10mg/L儲備液，再用一級水稀釋得到0.10，0.50，1.00，5.00，10.00，15.00，20.00mg/L的溶液。

將6種陽離子的混標(biāo)用一級水稀釋100倍，得到濃度為Li＋（0.50mg/L）、Na＋（2.00mg/L）、NH＋4（2.50mg/L）、K＋（5.00mg/L）、Mg2＋（2.50mg/L）、Ca2＋（5.00mg/L）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品處理

稱取試樣0.5～1.0g于10mL帶塞離心管，加2.0mL 60℃溫水，超聲提取5min、渦旋，再加入1.0mL乙酸渦旋，確定樣品溶液呈酸性，再加入7.0mL乙腈渦旋，－10℃6 000r/min冷凍離心20min，定量吸取上清液4.0mL氮?dú)獯蹈?，?.0mL一級水溶解，過0.20μm濾膜，備用。

1.5 樣品測定

試樣經(jīng)前處理后，按設(shè)置的色譜條件測定，采用外標(biāo)法定量，待測樣液中銨根離子的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，色譜峰保留時間應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一致。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

淋洗液的選擇與濃度直接影響色譜峰的分離效率和檢測的靈敏度。由于銨根離子為陽離子，故選擇甲磺酸或硫酸溶液作為淋洗液進(jìn)行考察。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甲磺酸溶液作為淋洗液時，系統(tǒng)的背景電導(dǎo)較高、基線噪音較大，而硫酸溶液作為淋洗液時背景信號低，能獲得較高的靈敏度，且淋洗液濃度變化后的平衡時間較短，所以選擇H2SO4淋洗液。

試驗(yàn)考察了5種常見的陽離子Li＋、Na＋、K＋、Mg2＋、Ca2＋對NH＋4離子是否存在干擾，圖1為10mmol/L H2SO4溶液恒流條件下，6種陽離子混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖。

由圖1可知，NH＋4離子的色譜峰緊接著Na＋離子出峰，出峰時間分別為5.337，4.680min，其分離度小于1.5，不能滿足檢測實(shí)際要求。而Na＋離子普遍存在于多種食品中且含量相對較高，對NH＋4離子極易造成干擾，通過調(diào)整梯度洗脫程序，在目標(biāo)離子出峰時間段降低淋洗液濃度，增加了NH＋4和Na＋離子的分離度，使其出峰時間相差達(dá)到2.6min，分離度增大到4以上，確保目標(biāo)離子不被干擾。NH＋4離子出峰后，加大淋洗液濃度，縮短檢測時間，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)際樣品試驗(yàn)得到滿意結(jié)果（見圖2）。最終確定了淋洗程序：0～18min，2.5mmol/L；18.1～40min，10mmoL/L；40.1～50min，2.5mmol/L。

圖1 10mmol/L H2SO4濃度下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Figure 1 Chromatogram of mixed standard solution with 10mmol/L H2SO4

圖2 梯度淋洗下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Figure 2 Chromatogram of mixed standard solution with gradient elution

2.2 線性關(guān)系與檢出限

以NH＋4離子的濃度與其定量離子對應(yīng)的峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法定量；以10倍的信噪比所對應(yīng)的待測物質(zhì)的濃度為最低定量濃度，即S/N＝10作為定量限LOQ為0.10mg/L；以3倍信噪比所對應(yīng)的待測物質(zhì)的濃度為最低檢出濃度，即S/N＝3作為檢測限LOD為0.05mg/L。NH＋4離子在0.1～20.0mg/L濃度范圍內(nèi)的線性方程為Y＝0.087 2＋0.162 7X、線性相關(guān)系數(shù)R2＝0.998 2。

2.3 樣品前處理優(yōu)化

乙腈作為通用的提取溶劑在殘留檢測方面得到廣泛的應(yīng)用，且本身對樣品中的糖、脂肪和蛋白質(zhì)的溶解性較小，對蛋白又有沉淀作用，所以試驗(yàn)選用乙腈水溶液作為提取溶劑。通過考察80%，70%，60%乙腈水溶液的沉淀蛋白效果，發(fā)現(xiàn)80%乙腈水溶液使蛋白質(zhì)迅速結(jié)塊，影響結(jié)果的重復(fù)性，60%乙腈水溶液沉淀蛋白速度較慢，且冷凍離心去除脂肪效果不佳。

選擇效果最好的70%的乙腈水溶液提取，于－10℃冷凍離心去除脂肪后，定量吸取上清液，氮?dú)獯蹈珊笥?mL一級水復(fù)溶，過0.20μm濾膜供離子色譜檢測，其加標(biāo)回收率幾乎為零。通過加入乙酸調(diào)節(jié)樣品處理液呈酸性，再加入乙腈沉淀蛋白后繼續(xù)進(jìn)行樣品處理，其回收率大幅提高，可滿足試驗(yàn)要求。

2.4 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

選取乳粉和豆?jié){為實(shí)際樣品，采用離子色譜技術(shù)檢測奶粉和豆?jié){中的銨根離子，按“1.4”的方法進(jìn)行試樣前處理，按“1.2”的色譜條件定量測定銨根離子并進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，獲得了良好試驗(yàn)結(jié)果，試樣檢測數(shù)據(jù)和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表1，相應(yīng)試樣處理液的色譜圖見圖3。

表1 實(shí)際樣品中銨根離子檢測數(shù)據(jù)表Table 1 Detection data and RSDs of NH＋4 in actual samples（n＝6）

2.5 加標(biāo)回收率

在10，20，40mg/kg 3個添加水平下，進(jìn)行準(zhǔn)確度試驗(yàn)，計算加標(biāo)平行樣（n＝8）的回收率得到：銨根離子添加回收率為73.8%～110.1%，詳見表2。

2.6 與標(biāo)準(zhǔn)方法比較

銨離子檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法有甲醛法和蒸餾法（半微量定氮法）。

圖3 實(shí)際樣品中NH＋4色譜圖Figure 3 Chromatograms of NH4＋in actual samples

甲醛法測定無機(jī)銨鹽是化學(xué)滴定法，在食用氯化鉀行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中明確了該試驗(yàn)方法。在甲醛法檢測NH＋4試驗(yàn)中，6mol甲醛與4mol NH＋4作用生成1mol質(zhì)子化的六亞甲基四胺和3mol的H＋，可與4mol的OH－直接滴定中和，其反應(yīng)的摩爾比是1∶1。該方法快速簡便，但甲醛毒性高，遇到樣品提取液背景色較深時指示劑顯色被嚴(yán)重干擾，難以判斷反應(yīng)終點(diǎn)。此外，該方法受到樣品自身游離酸干擾非常嚴(yán)重，只適用于基質(zhì)單一且水溶液為中性的樣品檢測，根本不能滿足食品檢驗(yàn)需求，故沒有對該方法進(jìn)行試驗(yàn)考察。

蒸餾法測定無機(jī)銨鹽是半微量定氮法，在醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中明確了該試驗(yàn)方法，本課題以奶粉為試樣，只對蒸餾法測定銨鹽進(jìn)行了考察。

稱取試樣0.5～1.0g于1 000mL圓底燒瓶，加300mL水溶解，連接蒸餾裝置后檢查氣密性，再加入45%氫氧化鈉溶液5mL加熱進(jìn)行試驗(yàn)。使用20mL 2%硼酸溶液作為吸收液，0.05mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液作為標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液。

表2 銨離子回收率Table 2 Recoveries of NH＋4spiked at different levels（n＝8）

試驗(yàn)得到20個檢測數(shù)據(jù)，計算得到精密度為9%。以空白的標(biāo)準(zhǔn)偏差為信號噪音，3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差為最低檢出限，通過計算為20mg/kg。試樣中定量添加硫酸銨或氯化銨水溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，計算加標(biāo)回收率為93%～103%。

試驗(yàn)結(jié)果表明：該方法穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度良好，但是靈敏度很低，檢測周期較長，操作繁瑣。由于樣品不經(jīng)過消解，大量的有機(jī)物會在蒸餾裝置中發(fā)生嚴(yán)重的鼓泡現(xiàn)象，直接影響檢測結(jié)果，無法滿足當(dāng)今食品非法添加物殘留檢測的要求。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用離子色譜技術(shù)，建立了食品中銨根離子的檢測方法，把硫酸銨、氯化銨和硝酸銨等一系列無機(jī)銨鹽打包處理，有效的監(jiān)控食品中銨根離子濃度是否異常，從而能夠判斷食品中是否存在人為摻假無機(jī)銨鹽的風(fēng)險。

1 弓曉峰，張靜，張振輝，等.納氏試劑比色法測定土壤銨態(tài)氮的研究［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2006，29（1）：43～44.

2 中華人民共和國國家經(jīng)濟(jì)貿(mào)易委員會.QB 2554——2002食用氯化鉀［S］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2002.

3 陸思偉，呂翔，王巖，等.蒸餾法和甲醛法測定高氯酸銨含量的比較［J］.無機(jī)鹽工業(yè)，2010，42（8）：60～61.

4 中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 5009.39——2003醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

5 Jota Kanda.Determination of ammonium in seawater based on the indophenol reaction with o－phenylphenol（OPP）［J］.Water Research，1995，29（12）：2 746～2 750.

6 Xiao－Li Su，Li－Hua Nie，Shou－Zhuo Yao.Determination of ammonium in Kjeldahl digests by gas－diffusion flow－injection analysis with a bulk acoustic wave－impedance sensor［J］.Talanta，1997，44（11）：2 121～2 128.

7 鐘志雄，李攻科，朱炳輝，等.離子色譜法同時測定化妝品中的銨和6種烷基胺［J］.色譜，2010，28（7）：702～707.

8 關(guān)良智，于泓.單柱離子色譜法同時測定堿金屬、銨離子和胺類［J］.色譜，1995，13（1）：53～54.

9 Christopher Pohl，Maria Rey，Detlef Jensen，et al.Determination of sodium and ammonium ions in disproportionate concentration ratios by ion chromatography［J］.Journal of Chromatography A，1999，850（1～2）：239～245.

10 Frédéric Gaucheron，Yvon Le Graet.Determination of ammonium in milk and dairy products by ion chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2000，893（1）：133～142.

Studies on determination of inorganic ammonia in foods by ion chromatography

WANG Zu－xiang YU Yang SUN LiJIANG Jun

（ZhenJiang Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhenjiang，Jiangsu212008，China）

A new method of ion chromatography（IC）was developed for the determination of inorganic ammonia in foods.Samples were soaked and mixed in water，acidified by acetic acid，and proteins were precipitated by adding acetonitrile and removed with fat by freezing centrifugation.Then the quantitative supernatant was evaporated to dry and the residues were filtrated with membrane and reserved for analysis after dissolved in 1mL water.The H2SO4solution was selected as the gradient elution at a flow rate of 1.0mL/min.The sample solution was separated by column DIONEX IonPac CS12A，and then detected by conductivity detector with suppressor.And external standard curve was used for the need of quantitative analysis.Results：The linear range of the method for NH＋4was 0.1～20.0mg/L，and the linear correlation coefficientR2was more than 0.995.The limit of detection（LOD）was 0.05mg/kg and the limit of quantitation（LOQ）was 0.1mg/kg.The recoveries were 74%～110%with the relative standard deviations（RSDs）less than 5%.Actual test results showed that the method was simple，sensitive and accurate，and was suitable for trace determination of NH＋4in many foods.

ion chromatography（IC）；non－protein nitrogen；ammonia；adulteration；quantitative detection

10.3969 /j.issn.1003－5788.2012.04.026

江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局項目（編號：2009KJ35）

王祖翔（1983－），男，鎮(zhèn)江出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心工程師。E－mail：wang＿zuxiang＠163.com

2012－01－15