鄧麗莉，潘曉倩，生吉萍,2，申 琳,*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中國(guó)人民大學(xué)農(nóng)業(yè)與農(nóng)村發(fā)展學(xué)院，北京 100872)

果蔬可溶性蛋白質(zhì)含量(soluble protein content)是一個(gè)重要的生理生化指標(biāo)，也是果蔬品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。許多可溶性蛋白是構(gòu)成果蔬中酶的重要組成部分，參與果蔬多種生理生化代謝過(guò)程的調(diào)控，與果蔬的生長(zhǎng)發(fā)育、成熟衰老，抗病性、抗逆性密切相關(guān)。此外，在以比活力(unit/mg protein)表示酶活力大小及酶制劑純度時(shí)，可溶性蛋白的測(cè)定也是必不可少的。因此，果蔬組織可溶性蛋白含量測(cè)定結(jié)果的客觀性就顯得尤為重要[1]。目前，1976年Bradford提出的考馬斯亮藍(lán)比色法是常用的果蔬組織微量可溶性蛋白測(cè)定方法，在茶葉[2]、水稻葉片[3]、小米[4-5]等多種植物組織可溶性蛋白測(cè)定和植物組織比酶活測(cè)定[6]等方面得到了廣泛的應(yīng)用。該方法標(biāo)本用量少、靈敏度高、重復(fù)性好，是一種較為理想的方法[7]。但該方法線性范圍窄，需要選擇適宜的提取緩沖液及緩沖液濃度、pH值、料液比和外源添加物等，以使測(cè)定方法有較高的靈敏度，測(cè)定值與真值相近。

本實(shí)驗(yàn)以紅星蘋果果肉為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)果實(shí)可溶性蛋白提取緩沖液、緩沖液濃度、pH值、外源添加物和料液比對(duì)果肉可溶性蛋白提取效率的影響的研究，優(yōu)化蘋果果實(shí)可溶性蛋白含量測(cè)定方法，以期優(yōu)化果實(shí)可溶性蛋白測(cè)定條件，為客觀反映果實(shí)可溶性蛋白水平提供一種可行的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新紅星蘋果產(chǎn)于北京市昌平區(qū)。

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(100μg/mL牛血清白蛋白)：稱取牛血清蛋白 25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸餾水稀釋至100mL；考馬斯亮藍(lán)試劑：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL 90%乙醇中，加入100mL 85g/100mL的磷酸，再用蒸餾水定容到1000mL，搖勻，過(guò)濾，貯于棕色瓶中。提取液(1)：pH 6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8和8.0梯度磷酸緩沖液(PBS)，配制方法見(jiàn)曹建康等[1]方法；提取液(2)：pH7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8和9.0梯度Tris-HCl緩沖液，配制方法見(jiàn)曹建康等[1]方法；梯度濃度Tris-HCl緩沖液(pH9.0)：10、30、50、80、100mmol/L；外源添加物及添加量：乙二胺四乙酸(EDTA)(1mmol/L)、聚乙烯比咯烷酮(PVP)(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl2(0.5mmol/L)、抗壞血酸(2mmol/L)、半胱氨酸(2mmol/L)、β-巰基乙醇(2%，V/V)。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 考馬斯亮藍(lán)G-250溶液及其蛋白反應(yīng)液全波長(zhǎng)掃描

取3mL配制好的考馬斯亮藍(lán)G-250溶液或其與蛋白反應(yīng)液，置于1cm光程玻璃比色皿中，以紫外分光光度計(jì)在400～800nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，確定考馬斯亮藍(lán)G-250溶液和其蛋白反應(yīng)液的最大吸收峰和空白吸收值。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取 6 支試管，按表1加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液和蒸餾水，混勻后，向各管中加入5mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液。每加完一支試管，立即在旋渦混合器上混合(注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除)?；旌虾箪o置5min左右，以0號(hào)試管為空白對(duì)照，在595nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程。

表 1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的各試劑添加量Table 1 Preparation of protein standard curve

1.3.3 果蔬組織可溶性蛋白質(zhì)的提取

1.3.3.1 最佳緩沖溶液和pH值的確定

稱取蘋果果肉樣品1g，加入5mL水或梯度pH值磷酸(PBS)緩沖液或Tris-HCl緩沖液，冰浴上充分研磨勻漿，移入10mL離心管中，于4℃、12000×g離心15min，收集上清液即為可溶性蛋白質(zhì)提取液，低溫保存?zhèn)溆肹8]。

1.3.3.2 最佳提取緩沖液濃度的確定

以1.2.3.1節(jié)確定的提取緩沖鹽和pH值為基準(zhǔn)，分別配制該pH值下濃度依次為0、10、30、50、80、100mmol/L的提取緩沖液[9]。提取體系及方法同1.2.3.1節(jié)。

1.3.3.3 適宜外源添加物的確定

以1.2.3.2節(jié)確定的最佳緩沖溶液為基準(zhǔn)，分別添加以下濃度的添加物：EDTA(1mmol/L)、PVP(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl2(0.5mmol/L)、抗壞血酸(2mmol/L)、半胱氨酸(2mmol/L)和β-巰基乙醇(2%，V/V)。提取體系及方法同1.2.3.1節(jié)[7-13]。

1.3.3.4 不同料液比提取

以1.2.3.3節(jié)確定的最終反應(yīng)體系為基準(zhǔn)，分別采取1：3、1：5、1：8、1：10、1：13、1：15、1：20和1：25的料液比制備蘋果組織可溶性蛋白質(zhì)提取液[14-16]。測(cè)定方法同1.2.3.1節(jié)。

1.3.4 蘋果組織可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

吸取1.0mL樣品上清液，放入試管中，加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，充分混合，放置5min后在波長(zhǎng)595nm處比色，按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線同樣的方法測(cè)定吸光度。重復(fù)3次。

式中：m’為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的蛋白質(zhì)的質(zhì)量/μg；V為樣品提取液總體積/mL；Vs為測(cè)定時(shí)所取樣品提取液體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Excel 2003 統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤并制圖。應(yīng)用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)，利用鄧肯式多重比較對(duì)差異顯著性進(jìn)行分析。每個(gè)提取條件重復(fù)測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 考馬斯亮藍(lán)G-250溶液及其蛋白反應(yīng)液吸收光譜掃描

由圖1A可以看出，考馬斯亮藍(lán)溶液的最大吸收峰在465.5～468.5nm范圍內(nèi)，此時(shí)，考馬斯亮藍(lán)溶液的吸光度為1.164，其在647nm處還有一個(gè)小的吸收峰(吸光度為0.823)。光譜范圍與文獻(xiàn)[1]報(bào)道一致。而圖1B顯示，蛋白提取液和考馬斯亮藍(lán)溶液反應(yīng)液的吸收光譜發(fā)生明顯改變，除了463～467nm處有小的吸收峰外(考馬斯亮藍(lán)G-250溶液本身吸收峰)，其最大吸收峰在632～637nm，此時(shí)反應(yīng)液的吸光度為1.048，與文獻(xiàn)報(bào)道的595nm有明顯出入，但測(cè)定時(shí)選取的595nm仍處于近峰頂位置上，此波長(zhǎng)下反應(yīng)液的吸光度為0.968。此外，與考馬斯亮藍(lán)溶液對(duì)應(yīng)的465.5～468.5nm范圍內(nèi)反應(yīng)液的吸光度為0.721～0.722，而632～637nm時(shí)，考馬斯亮藍(lán)溶液的吸光度范圍為0.790～0.808。

圖 1 考馬斯亮藍(lán)G-250溶液吸收光譜掃描圖(A)及其蛋白反應(yīng)液吸收光譜掃描圖(B)Fig.1 Absorption spectra of Coomassie brilliant blue G-250 solution (A) and its complex with protein (B)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

表 2 不同蛋白質(zhì)量濃度范圍內(nèi)考馬斯亮藍(lán)G-250法線性關(guān)系Table 2 Standard curve equations and corresponding linear ranges and correlation coefficients

由表2可以看出，可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度高時(shí)，考馬斯亮藍(lán)G-250染色法線性降低，R＝0.9929?？扇苄缘鞍踪|(zhì)量濃度在80μg/mL以內(nèi)時(shí)，該方法線性關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)R＝0.9992。因此，考慮到該方法高濃度時(shí)非嚴(yán)格的線性關(guān)系，實(shí)際應(yīng)用時(shí)，相關(guān)系數(shù)R在0.99～1范圍內(nèi)屬基本可以接受范圍。

2.3 不同緩沖體系對(duì)可溶性蛋白提取效果的影響

通常利用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定植物組織微量的可溶性蛋白時(shí)，常選用的提取液包括水、Tris-HCl緩沖液和磷酸(PBS)緩沖液[8]，但各類文獻(xiàn)中報(bào)道的緩沖液種類、pH值、濃度以及輔助添加物均不同，因此本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)進(jìn)一步比較系統(tǒng)的研究確定蘋果組織低量可溶性蛋白質(zhì)的提取條件。

2.3.1 不同緩沖溶液對(duì)可溶性蛋白提取效果的影響

2.3.1.1 磷酸鹽緩沖溶液

在磷酸鹽緩沖溶液(100mmol/L)有效緩沖范圍內(nèi)(5.7～8.0)選取如下pH值梯度：6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0。采取1：5料液比制備可溶性蛋白質(zhì)提取液，按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定提取液可溶性蛋白含量，測(cè)定結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，隨pH值升高，磷酸鹽緩沖溶液提取率基本呈增加趨勢(shì)；磷酸鹽緩沖溶液提取效果明顯好于水提效果，其中pH6.2磷酸鹽緩沖溶液提取效率最低，但提取的可溶性蛋白含量仍然比水提組高14.41%；提取緩沖液pH值為8.0時(shí)，可溶性蛋白提取效率最高，比水提組和pH6.2提取組分別高108.18%和81.96%。

圖 2 磷酸鹽(PBS)緩沖溶液(100mmol/L)不同pH值對(duì)可溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響Fig.2 Effect of PBS buffer pH on the extraction efficiency of soluble protein

2.3.1.2 Tris-HCl緩沖體系

圖 3 Tris-HCl緩沖溶液(100mmol)不同pH值對(duì)可溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響Fig.3 Effect of Tris-HCl buffer pH on the extraction efficiency of soluble protein

在Tris-HCl緩沖溶液(100mmol/L)有效緩沖范圍內(nèi)(7.0～9.2)選取如下pH值梯度：7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0。采取1：5料液比制備可溶性蛋白質(zhì)提取液，按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)定提取液可溶性蛋白含量，測(cè)定結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出：隨Tris-HCl緩沖溶液pH值的升高，可溶性蛋白質(zhì)的提取效率增加；且Tris-HCl緩沖溶液提取效果明顯優(yōu)于水提組，其中pH7.2的Tris-HCl緩沖溶液提取效率最低，但提取的可溶性蛋白含量仍然比水提組高25.94%；提取緩沖液pH值為9.0時(shí)提取效率最高，比水提組和pH6.2提取組分別高165.74%和111.01%。此外，整體上Tris-HCl緩沖溶液提取效率高于磷酸鹽(PBS)緩沖溶液。兩種緩沖溶液的最佳提取pH值分別為pH8.0和pH9.0，其中pH9.0 Tris-HCl緩沖溶液提取效率比pH8.0磷酸鹽緩沖溶液高27.65%。因此，蘋果果肉組織可溶性蛋白質(zhì)提取的適宜緩沖溶液為pH9.0 Tris-HCl緩沖溶液。

圖 4 不同pH值Tris-HCl緩沖溶液提取液褐變程度對(duì)比Fig.4 Effect of Tris-HCl buffer pH on the browning of protein extract

圖 5 不同提取緩沖溶液及pH值提取液褐變程度對(duì)比Fig.5 Effect of extraction buffer type and pH on the browning of protein extract

同時(shí)，從圖4、5可以看出，隨著Tris-HCl提取緩沖液或磷酸提取緩沖溶液pH值的增加，蘋果果肉提取液的顏色明顯加深，表明提取液中酶促褐變反應(yīng)加劇。而參與蘋果組織酶促褐變反應(yīng)的重要酶多酚氧化酶(PPO)也是果實(shí)組織可溶性蛋白的重要組分，褐變反應(yīng)的加劇，表明可能有部分可溶性蛋白在提取過(guò)程中損失，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)通過(guò)向提取溶液中添加外源添加物(酶保護(hù)劑或抑制劑)，控制提取過(guò)程中提取液中該部分可溶性蛋白的損失。

2.3.2 不同緩沖液濃度對(duì)可溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響

圖 6 不同提取緩沖溶液濃度對(duì)果實(shí)可溶性蛋白質(zhì)含量的提取效果Fig.6 Effect of Tris-HCl concentration on the extraction efficiency of soluble protein

常用可溶性蛋白質(zhì)提取緩沖液濃度為0.02～0.05mol/L緩沖體系，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，選擇0.01、0.03、0.05、0.08、0.1mol/L的pH9.0的Tris-HCl緩沖溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，低濃度pH9.0 Tris-HCl緩沖條件即可明顯提高可溶性蛋白的提取效率(如10mmol/L緩沖溶液可溶性蛋白提取量比對(duì)照水提組高61.66%)。且隨著Tris-HCl緩沖液濃度增加，可溶性蛋白的提取效率增加。增加趨勢(shì)在低濃度和高濃度時(shí)表現(xiàn)明顯，中間濃度時(shí)增加相對(duì)緩慢，30、50、80、100mmol/L緩沖溶液可溶性蛋白提取量分別比對(duì)照高134.63%、167.86%、189.84和299.94%。其中，100mmol/L緩沖液提取效果最佳，其可溶性蛋白有效提取量比80mmol/L緩沖液仍高出37.99%。

2.4 外源添加物對(duì)可溶性蛋白提取效果的影響

針對(duì)上述實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)生的酶促褐變等提取液的自身反應(yīng)問(wèn)題，以上述實(shí)驗(yàn)確定的100mmol/L pH9.0的Tris-HCl緩沖溶液為基礎(chǔ)提取液，添加蛋白酶保護(hù)劑和抑制劑，進(jìn)一步探討外源添加這些物質(zhì)對(duì)真實(shí)測(cè)定果蔬組織中可溶性蛋白質(zhì)的含量的影響。分別選取抗壞血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、β-巰基乙醇、NaCl、MgCl2以及這些試劑的不同組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以不添加任何添加物的100mmol/L pH9.0的Tris-HCl緩沖溶液為對(duì)照，結(jié)果如圖7所示。

圖 7 外源添加物對(duì)果實(shí)可溶性蛋白質(zhì)提取效果的影響Fig.7 Effect of exogenous additives on the extraction efficiency of soluble protein

圖7表明，單獨(dú)添加2mmol/L半胱氨酸對(duì)可溶性蛋白提取效果無(wú)明顯影響；單獨(dú)添加2mmol/L抗壞血酸、0.15mmol/L NaCl、2% β-巰基乙醇和0.5mmol/L MgCl2對(duì)該濃度和pH值的緩沖液可溶性蛋白的提取效率均有抑制作用，這4種物質(zhì)處理后，可溶性蛋白提取量分別比對(duì)照組低21.01%、22.73%、8.41%和9.36%。從β-巰基乙醇和PVP及EDTA的復(fù)合處理結(jié)果也可看出其對(duì)果實(shí)可溶性蛋白提取的抑制作用，PVP＋β-巰基乙醇處理組可溶性蛋白測(cè)定量比PVP處理組低5.05%，PVP＋EDTA＋β-巰基乙醇處理組可溶性蛋白含量比PVP＋EDTA組低10.69%；單獨(dú)添加PVP和EDTA均有助于提高果實(shí)可溶性蛋白的提取率，PVP效果(比對(duì)照高48.99%)好于EDTA(比對(duì)照高17.33%)。而PVP和EDTA復(fù)合處理效果比單獨(dú)處理效果更佳，其有效可溶性蛋白提取量達(dá)到0.311%，比對(duì)照高70.94%(1＋1＞2)。

作為一種蛋白質(zhì)巰基保護(hù)劑，β-巰基乙醇在防止蛋白質(zhì)巰基氧化方面得到了廣泛的應(yīng)用。在多種酶活測(cè)定中都有添加[1]。從對(duì)果實(shí)褐變的抑制效果看，褐變抑制效果最好的添加物包括抗壞血酸和β-巰基乙醇(圖8)，其他添加物無(wú)顯著作用，但這兩種物質(zhì)對(duì)可溶性蛋白的提取有一定的抑制作用。

圖 8 外源添加物對(duì)蘋果可溶性蛋白提取液褐變程度的影響Fig.8 Effect of exogenous additives on the browning of protein extract

此外，隨機(jī)選取兩組磷酸鹽緩沖液(pH值分別為6.4和6.8)，添加1% PVP和1mmol/L的EDTA，仍以1：5的料液比重復(fù)前述提取和測(cè)定過(guò)程，測(cè)定結(jié)果圖9所示。從圖9可以看出，外源添加1% PVP和1mmol/L的EDTA，可以極顯著的提高果蔬組織可溶性蛋白的提取率。pH6.4、6.8的復(fù)合提取液的可溶性蛋白提取量分別比原緩沖液增加165.87%和192.28%。pH6.8組可溶性蛋白測(cè)定量達(dá)0.308%，比水提組高322.26%(4.22倍)，與上述優(yōu)化的磷酸Tris-HCl緩沖液提取效果接近，表明外源添加物對(duì)果實(shí)可溶性蛋白的提取的影響作用明顯。

圖 9 外源添加1% PVP和1mmol/L的EDTA對(duì)可溶性蛋白提取量的影響Fig.9 Effect of simultaneous addition of exogenous PVP (1%) and EDTA (1 mmol/L) on the extraction efficiency of soluble protein as a function of pH

2.5 料液比對(duì)可溶性蛋白提取效果的影響

圖 10 不同料液比對(duì)可溶性蛋白提取量的影響Fig.10 Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction efficiency of soluble protein

實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步考察了料液比對(duì)果實(shí)可溶性蛋白提取效果的影響。以pH9.0 100mmol/L Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含1% PVP和1mmol/L EDTA)，設(shè)料液比1：3、1：5、1：8、1：10、1：13、1：15、1：20和1：25。選取的不同料液比的可溶性蛋白提取結(jié)果如圖10所示。

由圖10可知，料液比對(duì)果實(shí)可溶性蛋白的提前有顯著影響，隨著料液比增加，果實(shí)可溶性蛋白有效測(cè)定量呈直線上升。所選料液比中，料液比為1：25時(shí)可溶性蛋白有效提取量最高，比1：3和1：5料液比組分別高149.67%和99.07%，比水提組高644.83%(7.45倍)。表明料液比也是影響果實(shí)可溶性蛋白提取效果的重要因素。本實(shí)驗(yàn)以可溶性蛋白含量最高作為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定中是否存在干擾未加以驗(yàn)證，現(xiàn)有描述無(wú)法保證結(jié)果的準(zhǔn)確定。

3 結(jié) 論

上述研究結(jié)果表明，以考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定組織微量蛋白含量時(shí)，該方法的線性關(guān)系隨蛋白濃度增加而降低。果實(shí)可溶性蛋白提取受提取液pH值、緩沖鹽種類、緩沖鹽濃度、料液比、外源添加物PVP和EDTA等因素影響。實(shí)驗(yàn)最終確定的適用于蘋果果實(shí)可溶性蛋白含量測(cè)定的提取條件為，0.1mol/L pH 9.0 Tris-HCl提取緩沖液(內(nèi)含1mmol/L EDTA和1%PVP)，1：25料液比，此條件下，果實(shí)可溶性蛋白的有效測(cè)定含量為0.544%，為水提組(0.073%)的7.45倍。且產(chǎn)物吸光度在反應(yīng)后的5～20min內(nèi)保持穩(wěn)定。

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