夏海濤，劉玉芬，沈楊彬，金智彧

(淮海工學院化學工程學院，江蘇 連云港 222005)

山麻楂(Gypsophila oldhamiana Miq.)，又名山媽菜、長蕊石頭花、長蕊絲石竹、霞草等[1-2]，是石竹科石頭花屬植物，多年生草本。主要分布在我國河北、河南、江蘇、山東、陜西及甘肅等地[3]。民間多以其根部入藥[4]，具有清熱涼血、消腫止痛、化腐生肌長骨的功效，主治陰虛久瘧、潮熱、煩溫、骨蒸、盜汗、跌打損傷、骨折、外傷等癥[5-6]。植物化學研究表明山麻楂中主要含有黃酮、皂苷、甾醇、脂肪酸、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等化學成分[7-8]。黃酮類物質(zhì)具有保肝、降壓、抗癌、抗衰老、抗炎、降血糖、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等多種功能，還可有效清除羥自由基等活性氧組分[9-10]。因此山麻楂作為一種野菜資源，不但營養(yǎng)豐富，同時又具有醫(yī)療保健作用，開發(fā)前景廣闊。目前對山麻楂中黃酮類化合物提取工藝的響應(yīng)面法研究未見報道[11]。本實驗以黃酮提取率為考察指標，在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法對山麻楂黃酮提取工藝條件進行優(yōu)化，在獲得的最佳工藝條件下，對山麻楂根、莖、葉、花部位的黃酮進行提取和測定，為其開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山麻楂采自連云港市花果山，洗凈在60℃于電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干至質(zhì)量恒定，粉碎過40目篩。用石油醚浸泡去色，重復(fù)3次，余下的固體粉末揮發(fā)干備用。

95%乙醇、石油醚(均為分析純) 上海國藥集團；蘆丁標準品 中國食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550 型紫外分光光度計 日本島津公司；RE-5285A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；DHG-9240A 型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；KDM型控溫電熱套 浙江舟山海源儀器廠；TDL-4型臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；XA-1型固體粉碎機 金壇市科興儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 黃酮提取工藝流程

山麻楂嫩莖葉→清洗→干燥→粉碎→過篩→脫脂→浸提→離心→上清液→收集合并→測黃酮提取率。

準確稱取處理好的干燥山麻楂粉末0.5g，根據(jù)試驗設(shè)計條件，加入50%乙醇溶液提取2次，收集提取液、濃縮定容。

1.3.2 黃酮含量的測定

以蘆丁為標樣，按文獻[12]方法測定黃酮含量。移取一定量的黃酮提取液于25mL比色管中，加入70%乙醇定容，搖勻。在363nm處以試劑空白為參比測定吸光度，根據(jù)標準曲線方程計算黃酮含量和黃酮提取率。蘆丁標準曲線回歸方程為A= 0.0261＋0.0287x，相關(guān)系數(shù)R=0.9980，式中x為蘆丁質(zhì)量濃度，范圍為5.0～32mg/L，A為吸光度。

1.3.3 單因素試驗

分別以不同的乙醇體積分數(shù)、液料比、提取溫度、提取時間以及提取次數(shù)為單因素進行試驗，考察其對山麻楂中黃酮提取率的影響。

1.3.4 Box-Behnken試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，確定Box-Behnken設(shè)計的自變量，以山麻楂總黃酮提取率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析對提取條件進行優(yōu)化。試驗因素水平編碼設(shè)計見表1。數(shù)據(jù)處理采用Design Expert 8.05統(tǒng)計軟件分析。

表 1 山麻楂黃酮提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對黃酮提取率的影響

在提取溫度70℃、提取時間60min、提取2次、液料比20：1的條件下，加入不同體積分數(shù)乙醇溶液提取黃酮，所得結(jié)果見圖1。隨乙醇體積分數(shù)的增大，黃酮提取率開始增大，在乙醇體積分數(shù)50%時，黃酮提取率最高，隨后下降。這可能是乙醇體積分數(shù)較高時，脂溶性雜質(zhì)溶出增多并與黃酮類物質(zhì)競爭溶劑[13]，從而使黃酮提取率下降。

圖 1 乙醇體積分數(shù)對黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of flavonoids

2.1.2 提取時間對黃酮提取率的影響

在提取溫度70℃、液料比20：1、乙醇體積分數(shù)50%、提取2次的條件下，考察提取時間對黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖2。隨著提取時間的增加，黃酮提取率呈正向增長趨勢，在提取時間小于100min時，隨時間延長，黃酮提取率升高顯著，達到100min后，繼續(xù)增加提取時間，黃酮提取率增長緩慢，110min達最大值，隨后略有下降，可能黃酮浸出率達到了動態(tài)平衡，部分山麻楂黃酮被氧化所致。

圖 2 提取時間對黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction yield of flavonoids

2.1.3 提取溫度對黃酮提取率的影響

在提取時間60min、液料比20：1、乙醇體積分數(shù)50%、提取2次條件下，考察提取溫度對黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖3。隨著提取溫度的升高，黃酮提取率增加，超過70℃后，黃酮提取率下降。在高溫環(huán)境下，黃酮類物質(zhì)易于氧化，而且溫度高時雜質(zhì)的溶出量也會增加，導致提取率下降。

圖 3 提取溫度對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of flavonoids

2.1.4 液料比對黃酮提取率的影響

在提取溫度70℃、提取時間60min、乙醇體積分數(shù)50%、提取2次的條件下，考察液料比對黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖4。黃酮提取率隨著液料比的增加而上升，在液料比超過25：1后，黃酮提取率下降。溶劑用量少，黃酮溶出量小，提取不完全，溶劑用量過大，成本增加，綜合考慮經(jīng)濟因素和后續(xù)工藝的簡化，液料比25：1為宜。

圖 4 液料比對黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of solvent-to-solid ratio on the extraction yield of flavonoids

2.1.5 提取次數(shù)對黃酮提取率的影響

圖 5 提取次數(shù)對黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction number on the extraction yield of flavonoids

在提取溫度70℃、提取時間60min、乙醇體積分數(shù)50%、液料比20：1的條件下，考察提取次數(shù)對黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖5。隨提取次數(shù)的增加，黃酮提取率明顯增加，提取次數(shù)達到2次后，再增加提取次數(shù)黃酮提取率變化不明顯，說明山麻楂黃酮經(jīng)過2次提取后已接近完全。因此，從減少操作環(huán)節(jié)，節(jié)約成本考慮，黃酮重復(fù)提取2次為宜。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，選擇提取溫度、提取時間、液料比進行三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，確定黃酮最佳提取條件，結(jié)果見表2。將所得的試驗數(shù)據(jù)采用Design Expert軟件進行多元回歸擬合，得到黃酮提取率對提取溫度A、提取時間B、液料比C的二次多項回歸方程：

黃酮提取率/%=2.6308－0.0334A＋0.0175B＋0.0529C－0.0368AB－0.1655AC＋0.0193BC－0.1107A2－0.1044B2－0.1692C2

表 2 山麻楂黃酮提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

回歸模型的響應(yīng)曲面見圖6。從響應(yīng)面分析圖上看，在所選實驗條件范圍內(nèi)存在響應(yīng)面最高點。圖6a表明，當液料比固定為25：1(mL/g)時，隨提取時間和溫度的增加黃酮提取率呈上升趨勢，當提取溫度和時間達到68.29℃和111.12min時，黃酮提取率達到最大值，此后沒有進一步提高而是有所下降，可能是由于時間長、溫度高使黃酮分解。由等高線可知，沿提取溫度軸向等高線相對密集，說明提取溫度對黃酮提取率的影響比時間大。等高線呈橢圓形，表明兩因素交互作用較強，影響顯著[15]。圖6b表明，黃酮提取率隨液料比和溫度的提高快速增加，在液料比為26.82：1(mL/g)、溫度為65.76℃附近可以達到響應(yīng)值最高點。等高線呈橢圓形，表明兩因素有明顯的交互作用，影響顯著，且液料比(等高線較密集)對黃酮提取率的影響明顯大于提取溫度。圖6c表明，黃酮提取率隨液料比和時間的增加先增大后減小。等高線圖表明，液料比對響應(yīng)值的影響比時間影響顯著。在液料比25.79：1(mL/g)、時間111.09min附近可以達到響應(yīng)值最高點。

表 3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for the established regression model

圖 6 各兩因素交互作用對黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of on three process parameters on the extraction yield of flavonoids

2.3 山麻楂中黃酮最佳提取條件的確定和驗證實驗

通過軟件Design-Expert求解回歸方程，得到山麻楂總黃酮的最佳提取工藝條件為提取溫度65.09℃、提取時間112.08min、液料比27.04：1(mL/g)，黃酮提取率的預(yù)測值為2.652%。考慮實際操作，將實驗條件修改為提取溫度65℃，提取時間112min、液料比27：1(mL/g)。在此條件下將樣品量放大20倍重復(fù)提取3次，測定實際提取率為2.649%，與預(yù)測值基本吻合，偏差較小。說明得到的回歸模型與實際情況擬合很好，進一步驗證了該模型的可行性。

2.4 山麻楂不同部位黃酮含量的測定

在最佳工藝條件下，分別對山麻楂根、莖、葉、花不同部位的黃酮進行提取測量，結(jié)果表明，山麻楂不同部位的黃酮含量差異較大，含量從高至低依次是：葉(5.264%)＞花(2.983%)＞莖(2.145%)＞根(1.861%)。山麻楂葉中總黃酮的含量約為地下部分的3倍，說明增加光照有利于黃酮的合成。嫩葉部分接受光能較多，合成了較多的黃酮，莖部接受光能少，根部位基本上不接受光照，其黃酮含量較低。

3 結(jié) 論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法建立了山麻楂中黃酮提取率與溫度、時間、液料比之間關(guān)系的二次多項回歸模型，經(jīng)驗證該模型擬合程度高，準確有效。優(yōu)化得到的最佳提取工藝修正條件為提取溫度65℃、提取時間112min、液料比27：1(mL/g)，在此條件下得到的實際黃酮提取率與預(yù)測值基本吻合，說明Box-Behnken設(shè)計法用于山麻楂中黃酮提取工藝的優(yōu)化篩選是可行的，能較好地預(yù)測山麻楂黃酮的提取率。山麻楂黃酮含量從部位分布來看，葉含量均高于根、莖、花部分，針對山麻楂黃酮類成分的開發(fā)利用應(yīng)重點選擇葉片部位，花、莖、根部中黃酮類成分含量雖然較葉低，但也具有重要的經(jīng)濟價值，也可作為獲取黃酮類成分的重要原料。

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