王金玲，江連洲*，許 晶

(1.東北農(nóng)業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江職業(yè)學院，黑龍江 雙城 150111；3.國家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150030)

近年來，大豆多肽的生理活性受到人們越來越多的重視。大豆多肽是一種多功能保健因子，具有降低血清膽固醇、抑制血壓升高等生理活性[1-6]。在無副作用的前提下，既滿足了人們營養(yǎng)需求，又滿足了人們保健的需求。

目前，大豆的利用主要是大豆蛋白和大豆油脂的制取及精深加工。其中高變性豆粕是大豆加工中的主要副產(chǎn)品，含有豐富的蛋白質(zhì)，但由于此蛋白質(zhì)變性程度較高，僅作為飼料及釀造食品原料，造成了一定的資源浪費。若能以高變性豆粕為原料采用微生物發(fā)酵或生物酶酶解技術(shù)生產(chǎn)大豆多肽，既促進了大豆多肽產(chǎn)品的研發(fā)和應用，又降低了大豆多肽的生產(chǎn)成本，將會具有良好的應用前景及經(jīng)濟價值[7-8]。為此，本研究在大量實驗的基礎(chǔ)上，深入研究Alcalase堿性蛋白酶酶解高變性豆粕蛋白的工藝條件，以及最佳條件下的豆粕酶解多肽的降血脂功能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高變性豆粕 黑龍江省九三油脂有限公司；堿性蛋白酶(經(jīng)測定酶活為120899U/g) 丹麥Novo公司；SD小鼠(體質(zhì)量12～14g，雄性)、飼料(基礎(chǔ)飼料) 漢方生物養(yǎng)殖所；高脂飼料(配方[9-10]為基礎(chǔ)飼料79%、蛋黃粉10%、熟豬油10%、膽固醇1%)為自行配制。

pHS-25型酸度計 上海偉業(yè)儀器廠；AE100電子分析天平 梅勒特-托利多儀器(上海)有限公司；LD4-2A離心機 北京醫(yī)用離心機廠；全自動生化分析儀 意大利BSI公司；TGL-16B臺式高速離心機(16000r/min) 湖南星科科學儀器有限公司；190噴霧干燥機 瑞士Büchi公司。

1.2 方法

1.2.1 指標測定

水解度：通過pH-stat法[11-13]測定并計算蛋白質(zhì)的水解度。

式中：V(NaOH)為消耗堿液的體積/mL；N(NaOH)為消耗堿液的的摩爾濃度/(mol/L)；α為氨基酸的解離數(shù)；Mp為參加水解的蛋白總量/g；Htot為每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的物質(zhì)的量/mmol。

血清總甘油三酯(triglyceride，TG)、血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high densitylipoprotein cholesterol，HDL-C)直接利用全自動生化分析儀測定；動脈硬化指數(shù)(arteriosclerosis index，AI)根據(jù)Fridewaid公式計算：

1.2.2 酶解工藝及操作要點

操作要點：本實驗中堿性蛋白酶水解高變性豆粕的條件范圍是在參考堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白的工藝條件以及預實驗的基礎(chǔ)上確定的[14-16]。配制一定濃度的高變性豆粕溶液，在一定溫度條件下，依據(jù)所用酶的活力，準確添加蛋白酶，使其在不斷攪拌下酶解，反應過程中用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)體系酸堿度至實驗pH值，并維持其不變。反應到預定時間，90℃加熱20min，鈍化蛋白酶，終止酶解反應。經(jīng)冷卻后的酶解液于4000r/min離心20min，得到上面澄清的豆粕蛋白酶解肽溶液。取上清液，按照pH-stat法計算水解度，噴霧干燥后，得到肽產(chǎn)品備用。

1.2.3 動物實驗分組

所有實驗小鼠先適應性喂養(yǎng)基礎(chǔ)飼料4d。取42只小鼠，16只為正常對照組，喂基礎(chǔ)飼料，其余為高脂模型組，給予高脂飼料(自制)。連續(xù)喂養(yǎng)1周后，每組各隨機抽取6只小鼠，空腹12h，摘眼球取血，測定血清脂質(zhì)含量，并以高脂模型組血清TG含量顯著的高于正常對照組為確定造模成功的指標[17-19]。將高血脂小鼠隨機分成2組，每組10只，分別為高脂對照組、堿性酶解肽組。試驗組以每天每只小鼠0.5mL的量灌胃，堿性酶解肽組按人體推薦劑量的5倍定劑量灌胃，酶解多肽溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，灌胃情況見表1。實驗連續(xù)進行4周后，取小鼠血清，測定各項脂質(zhì)指標。

表 1 試驗設計方案Table 1 Animal groups and treatments

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

正交試驗的結(jié)果分析采用正交設計助手Ⅱ V3.1分析軟件進行數(shù)據(jù)處理。動物實驗數(shù)據(jù)采用t檢驗，結(jié)果以“平均值±標準差”的方式表示，采用Excel 2003和SPSS 13.0軟件數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性蛋白酶最佳水解條件的確定[15-16]

2.1.1 酶添加量對水解度的影響

在溫度55℃、pH8.5、底物質(zhì)量濃度5g/100mL、酶添加量(每克底物)分別為4800、9600、14400、19200、24000U/g條件下酶解4h，測定水解度，確定最佳酶添加量。

圖 1 酶添加量對水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on degree of hydrolysis

由圖1可以看出，酶添加量對水解效果的影響極為顯著(P＜0.01)。水解度隨著酶添加量的增加呈上升趨勢，但其變化幅度逐漸趨緩。當酶添加量為14400U/g時，水解度達到最大，之后水解度變化緩慢，且與14400U/g相比較差異不顯著(P＞0.05)。原因可能是酶添加量過高，底物被飽和，過剩的酶分子沒有底物可以作用[20]。因此，綜合考慮生產(chǎn)成本，確定酶添加量為14400U/g。

2.1.2 酶解時間對水解度的影響

在溫度55℃、pH8.5、酶添加量14400U/g、底物質(zhì)量濃度5g/100mL條件下，分別酶解1、2、3、4、5h，測定水解度，確定最佳酶解時間。

由圖2可以看出，酶解時間對水解效果的影響極為顯著(P＜0.01)。水解度隨著時間的延長呈上升趨勢，但其變化幅度逐漸趨緩。4h時水解度基本達到最大值。原因可能是隨著時間的延長，蛋白酶可水解的肽鍵逐漸減少，同時蛋白酶的活力也會有所下降[21]。因此，綜合考慮成本問題，確定酶解時間為4h。

圖 2 酶解時間對水解度的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis

2.1.3 pH值對水解度的影響

在溫度55℃、酶添加量14400U/g、底物質(zhì)量濃度5g/100mL、pH值分別為7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0條件下酶解4h，測定水解度，確定最適pH值。

圖 3 pH值對水解度的影響Fig.3 Effect of pH on degree of hydrolysis

由圖3可以看出，pH值對水解效果的影響極顯著(P＜0.01)。pH值過高或者過低對豆粕中蛋白水解效果均不利。在pH值為7.5～10.0的范圍內(nèi)，隨著pH值增大，水解度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。pH9.0時水解度達到最大值。原因可能是溶液的酸堿環(huán)境影響酶的空間構(gòu)象以及影響底物的解離狀態(tài)[20]。由于pH8.5和pH9.0之間差異不顯著(P＞0.05)，因此確定pH值為8.5。

2.1.4 酶解溫度對水解度的影響

圖 4 酶解溫度對水解度的影響Fig.4 Effect of temperature on degree of hydrolysis

在pH9.0、酶添加量14400U/g、底物質(zhì)量濃度5g/100mL、酶解溫度分別為40、45、50、55、60、65℃條件下酶解4h，測定水解度，確定最佳酶解溫度。

由圖4可以看出，酶解溫度對水解效果的影響極顯著(P＜0.01)。溫度過高或者過低對豆粕中蛋白水解效果均不利。在40～65℃的范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，水解度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。55℃時水解度達到最大值，并且與60℃和65℃相比較差異顯著(P＜0.05)。原因可能是溫度對酶的熱變性作用[21]。因此確定酶解溫度為55℃。

2.1.5 底物質(zhì)量濃度對水解度的影響

在溫度55℃、pH9.0、酶添加量14400U/g，底物質(zhì)量濃度分別為3、5、7、9、11g/100mL條件下酶解4h，測定水解度，確定最佳底物質(zhì)量濃度。

圖 5 底物質(zhì)量濃度對水解度的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on degree of hydrolysis

由圖5可以看出，底物質(zhì)量濃度對水解效果的影響極顯著(P＜0.01)。底物質(zhì)量濃度過高或者過低對豆粕水解效果均不利。在底物質(zhì)量濃度3～11g/100mL范圍內(nèi)，水解度隨底物質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。底物質(zhì)量濃度為5g/100mL時，水解度達到最大值。原因可能是底物質(zhì)量濃度過高，酶分子被飽和，對水解還有一定的抑制作用[22]。因此，確定底物質(zhì)量濃度為5g/100mL。

2.2 正交試驗[20]

表 2 Alcalase堿性蛋白酶水解高變性豆粕中大豆蛋白正交試驗設計及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design arrangements and results for optimization of HTSM hydrolysis by alcalase

由表2可知，各因素對水解度的影響主次順序為：底物質(zhì)量濃度＞酶添加量＞酶解pH值＞酶解時間＞酶解溫度。反應條件的最佳組合為A2B2C3D2E4，即底物質(zhì)量濃度5g/100mL、酶添加量14400U/g、pH9.0、酶解溫度55℃、酶解時間5h。但是依據(jù)綜合試驗效果和生產(chǎn)成本情況下酶解時間確定為4h。經(jīng)驗證實驗，在此條件下水解度可達到37.5%。

2.3 酶解多肽的降血脂功能

2.3.1 對小鼠體質(zhì)量的影響

表 3 大豆肽對小鼠體質(zhì)量的影響Table 3 Effect of soybean peptides on mouse body weight

由表3可知，實驗進行的4周內(nèi)，飼喂高脂飼料的實驗組小鼠體質(zhì)量都顯著高于基礎(chǔ)飼料組(P＜0.05)。高脂對照組與酶解肽組相比體質(zhì)量有增長趨勢，但兩者之間無明顯差異(P＞0.05)。結(jié)果表明，灌胃豆粕酶解肽對小鼠的體質(zhì)量不會造成影響。大豆蛋白為高生物效價的蛋白質(zhì)，可維持動物正常生長。

2.3.2 對小鼠血清脂質(zhì)的影響

表 4 大豆肽對小鼠血清TG、TC含量的影響Table 4 Effect of soybean peptides on serum TG and TC levels in mice

表 5 大豆肽對小鼠血清HDL-C含量和AI的影響Table 5 Effect of soybean peptides on serum HDL-C and AI levels in mice

由表4、5可知，第0周時，飼喂高脂飼料的小鼠的血清TG顯著高于飼喂基礎(chǔ)飼料小鼠(P＜0.05)，說明高脂小鼠模型已成功建立。第4周的小鼠血清脂質(zhì)測定結(jié)果表明，堿性酶酶解大豆多肽可極顯著降低小鼠的AI值(P＜0.01)，顯著降低血清TC值，提高血清HDL-C值(P＜0.05)，對于小鼠的血清TG值的降低也具有一定的顯著性(P＜0.1)。根據(jù)《保健食品功能學評價程序和檢驗方法》中的降血脂食品的判定標準，2項或2項以上指標陽性，可判定有調(diào)節(jié)血脂作用[19]。因此，可以確定酶解大豆多肽具有降血脂的功能。

3 結(jié) 論

堿性蛋白酶水解高變性豆粕的最佳工藝條件為底物質(zhì)量濃度5g/100mL、酶添加量14400U/g、pH9.0、酶解溫度55℃、酶解時間4h，在此條件下堿性蛋白酶水解高變性豆粕的水解度為37.5%。利用高變性豆粕制備的大豆多肽制品具有一定的降血脂功能。因此，制備豆粕功能性多肽制品是可行的，既降低了大豆肽的成本，又提高了高變性豆粕的附加值。

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