尹傳昌， 廖曉峰， 陳 雯， 郭躍清， 易繼林， 李興?！?/p>

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 1 普外科，2 婦產(chǎn)科，武漢 430030

腫瘤組織中細(xì)胞外基質(zhì)是一種由膠原蛋白、糖蛋白和蛋白多糖構(gòu)建成的復(fù)雜小梁結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)參與細(xì)胞間相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、增殖和分化［1］。腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用對(duì)于腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移起著很重要的作用。Tenascin（TN）是細(xì)胞外基質(zhì)中具有獨(dú)特六臂體結(jié)構(gòu)的高分子糖蛋白［2－3］，共有3種異構(gòu)分子，主要由幼稚時(shí)期的成纖維細(xì)胞合成［4－5］。研究表明Tenascin－C是細(xì)胞外基質(zhì)中調(diào)節(jié)上皮和間質(zhì)組織生長(zhǎng)的重要成分［6］。盡管Tenascin－C在正常組織中表達(dá)很低，但在人體惡性實(shí)性腫瘤中，如乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌和黑色素瘤中均呈高表達(dá)［7－11］。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明Tenascin－C與腫瘤浸潤(rùn)相關(guān)，它可促進(jìn)腫瘤血管生長(zhǎng)、腫瘤細(xì)胞繁殖以及抑制腫瘤免疫反應(yīng)［12］。原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球最常見(jiàn)惡性腫瘤之一［13］。HCC 血供極為豐富，故新生血管的形成可能對(duì)該類腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移都有很大影響。微血管密度（MVD）是評(píng)估腫瘤新生血管的金指標(biāo)，與各種腫瘤預(yù)后密切相關(guān)［14－16］。HCC 中MVD 越高，其進(jìn)展速度就越快，預(yù)后就越差。MVD也可以作為生物學(xué)標(biāo)記來(lái)區(qū)分良惡性肝臟病變［17］。至今為止，人們對(duì)Tenascin－C 在HCC 中的表達(dá)及其相關(guān)作用了解甚微。本研究，我們不僅對(duì)HCC、肝硬化以及正常肝組織中Tenascin－C 的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估，同時(shí)也對(duì)Tenascin－C 表達(dá)與臨床病理指標(biāo)和MVD 相關(guān)性進(jìn)行檢驗(yàn)與分析，以了解其在HCC浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和血管生成中的作用。

1 材料與方法

1.1 患者一般情況

所有病例均來(lái)自2000年至2005年武漢市同濟(jì)醫(yī)院普外科HCC手術(shù)患者標(biāo)本。54例HCC患者，其中女性35例，男性19例；平均年齡（44.6±11.6）歲（24～77歲）；其中29例發(fā)生轉(zhuǎn)移；3例合并肝硬化。術(shù)前檢查甲胎蛋白（AFP）陰性患者（＜400μg／mL）19例，陽(yáng)性患者35例。手術(shù)后，對(duì)54例HCC患者進(jìn)行為時(shí)30個(gè)月的隨訪，收集到46例患者資料，其他8例患者失訪。隨訪期間，46例HCC患者中有37 例（80.4%）死亡。此外，取肝硬化標(biāo)本32例和肝臟外傷標(biāo)本17例作為對(duì)照，其中包括34例男性標(biāo)本和15例女性標(biāo)本，患者平均年齡（43.4±10.4）歲。本研究獲同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 組織標(biāo)本處理

將HCC手術(shù)切除標(biāo)本中一部分儲(chǔ)存于－70℃環(huán)境，備用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）。其余的用10%多聚甲醛溶液固定，再用石蠟包埋待用。對(duì)HCC 標(biāo)本進(jìn)行Edmondson－Steiner標(biāo)準(zhǔn)分期：Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期24例。并記錄標(biāo)本腫瘤大小及有無(wú)包膜侵犯。每一個(gè)標(biāo)本組織塊均勻切成4μm 薄片用于蘇木精－伊紅染色。所有的HCC病理診斷均由2位病理學(xué)研究人員獨(dú)自完成。

1.3 Tenascin－C的免疫組織化學(xué)染色

組織切片用二甲苯進(jìn)行脫蠟，水化。切片經(jīng)PBS水浴10min再冷卻20min行修復(fù)抗原，然后浸泡在3%過(guò)氧化氫內(nèi)5min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。隨后，加一抗即抗Tenascin－C 小鼠單克隆抗體孵育（NeoMarkers公司，美國(guó)）4℃過(guò)夜。次日用抗鼠生物素二抗（SP試劑盒，晶美公司）孵育30min，然后與親和素－生物素復(fù)合物（SP 試劑盒，晶美公司）反應(yīng)，并用二氨聯(lián)苯胺四鹽酸鹽（DAB，晶美公司）處理。標(biāo)本玻片通過(guò)蘇木精染色，無(wú)水乙醇脫水，固定于玻片上。以PBS緩沖液取代一抗作為陰性對(duì)照；用明確診斷的乳腺癌標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。Tenascin－C陽(yáng)性產(chǎn)物為細(xì)胞質(zhì)中的棕黃色顆粒，且在細(xì)胞外基質(zhì)中形成微小的、連續(xù)的或不連續(xù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。隨機(jī)選擇5處陽(yáng)性區(qū)域進(jìn)行分析。采用HPIAS－1000高精度彩色圖像測(cè)量系統(tǒng)（同濟(jì)強(qiáng)平形象工程公司）測(cè)定吸光度值，以此反映Tenascin－C免疫反應(yīng)表達(dá)量。.

1.4 血管密度分析

用內(nèi)皮細(xì)胞表面分子（CD34）單克隆抗體（Dako公司，丹麥），根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用鏈霉素抗生物素－免疫過(guò)氧化物酶技術(shù)來(lái)進(jìn)行微血管的鑒別。切片脫蠟和水化，用3%過(guò)氧化氫處理10min以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。用PBS洗滌后，在4℃下一抗孵育過(guò)夜備用。在PBS洗滌后，采用二抗（試劑C）和鏈霉素過(guò)氧化物酶復(fù)合物進(jìn)一步清洗（試劑A ＋B），各用時(shí)30min。標(biāo)本玻片通過(guò)蘇木精染色，無(wú)水乙醇脫水，封片。按照Araya等［18］制定的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)衡量MVD 數(shù)值大小。染為棕色的單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)，無(wú)論是否具備血管腔結(jié)構(gòu)，均稱為微血管。先在100倍光學(xué)顯微鏡下觀察玻片，選擇HCC 脈管最多的區(qū)域，接著在200倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野下的脈管平均數(shù)記為MVD 值。

1.5 RT－PCR檢測(cè)

依據(jù)說(shuō)明書(shū)用Trizol 試劑（Life Technologies，Grand Island，NY）提取總RNA，通過(guò)M－MLV逆轉(zhuǎn)錄酶以及Oligo dT引物（晶美公司）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA［19］。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物行PCR 擴(kuò)增。Tenascin－C 引物序列為：上游5′－GAGATTTAGCCGTGTCTGAGGTTG－3′；下游5′－AGGAGAGATTGA－AGCTCTCG－3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為2 237bp；以β－actin為內(nèi)參照，引物序列為：上游5′－CCTTCCTTCCTGGGCATG－3′，下游5′－GAGCAATGATCTTGATCTTC－3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為287bp。將5μL cDNA 產(chǎn)物混入由PCR 緩沖液5 μL，2.5mmol／L的dNTP 2μL，5U／L Taq DNA 聚合酶0.5μL（晶美公司），以及2 種濃度均為10 μmol／L的引物溶液2μL 組成共計(jì)50μL 的混合物中。PCR反應(yīng)條件如下：預(yù)變性94℃2min，變性94℃30s，60℃30s和72℃60s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，延伸72℃2min。用含有溴化乙啶的2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物。以凝膠圖像分析系統(tǒng)計(jì)算電泳條帶的吸光度值，以Tenascin－C／β－actin吸光度比值作為定量分析指標(biāo)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)。根據(jù)Kaplan－Meier法分析生存資料。使用Log－rank檢驗(yàn)法衡量生存組間的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)MVD 和Tenascin－C 的相關(guān)性進(jìn)行線性回歸分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tenascin－C在不同肝組織內(nèi)的表達(dá)情況

免疫組化染色結(jié)果顯示：54例HCC 組織中有34例（約63.0%）Tenascin－C（＋），32例肝硬化組織中有6 例（18.8%）Tenascin－C（＋），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝14.06，P＜0.01）。正常肝組織中除少部分管壁交叉反應(yīng)導(dǎo)致的弱陽(yáng)性外，尚未發(fā)現(xiàn)Tenascin－C表達(dá)。Tenascin－C在不同肝臟組織內(nèi)的表達(dá)強(qiáng)度具有明顯差異，肝硬化組織內(nèi)Tenascin－C 的表達(dá)強(qiáng)度（149.24±8.25）明顯低于 HCC 組織［（162.15±9.77），t＝2.192，P＜0.05］。HCC 組織內(nèi)Tenascin－C主要位于癌灶細(xì)胞外間質(zhì)，形成灶性褐色的連續(xù)或者不連續(xù)的條索及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在HCC的癌巢內(nèi)和基底膜新生微小血管內(nèi)亦可見(jiàn)Tenascin－C（圖1）。Tenascin－C 在癌巢邊緣含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于癌巢中心的含量［（165.23± 7.25）vs.（156.02±7.95），t＝2.119，P＜0.05］。

圖1 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)HCC和正常肝組織中的Tenascin－C表達(dá)（DAB顯色）Fig.1 Immunohistochemical detection of Tenascin－C in HCC and normal hepatic tissues（DAB staining）

2.2 Tenascin－C mRNA的表達(dá)

圖2為T(mén)enascin－C mRNA 在不同的肝組織內(nèi)表達(dá)情況。HCC內(nèi)Tenascin－C mRNA 含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于肝硬化組織內(nèi)的含量［（0.593±0.110）vs.（0.138±0.089），t＝2.894，P＜0.05］。在正常肝組織中并未檢測(cè)到Tenascin－C表達(dá)。

圖2 RT－PCR檢測(cè)不同肝組織中Tenascin－C mRNA 的表達(dá)Fig.2 Expression of Tenascin－C mRNA detected by using RT－PCR

2.3 Tenascin－C表達(dá)與HCC病理特征的關(guān)系

由表1可見(jiàn)，HCC患者中Tenascin－C表達(dá)有包膜浸潤(rùn)者明顯高于無(wú)浸潤(rùn)者（P＜0.05），Edmondson－Steiner病理分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)者明顯高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)者（P＜0.05）、腫瘤有轉(zhuǎn)移者明顯高于無(wú)轉(zhuǎn)移者（P＜0.01），而Tenascin－C表達(dá)在不同腫瘤大小者、AFP是否陽(yáng)性者以及是否合并肝硬化者之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。隨訪的46例HCC患者平均隨訪時(shí)間為11.5個(gè)月（3～30個(gè)月），隨訪期間Tenascin－C陰性表達(dá)患者比Tenascin－C陽(yáng)性表達(dá)患者的中位生存時(shí)間長(zhǎng)［分別為（22.01±6.95）月vs.（15.08±7.06）月，P＜0.05，log－rank test，圖3］。

表1 Tenascin－C與HCC臨床病理特征之間的關(guān)系Table 1 Correlation of Tenascin－C immunostaning with clinicopathological features in HCC

圖3 隨訪的46例HCC患者的Kaplan－Meier生存曲線Fig.3 Kaplan－Meier survival curves of 46patients with HCC

2.4 MVD以及Tenascin－C的表達(dá)和HCC病理特征的關(guān)系

HCC組織內(nèi)微血管大量出現(xiàn)在癌旁組織，特別在毗鄰的浸潤(rùn)性腫瘤的邊緣處（圖4）。Tenascin－C表達(dá)與MVD 呈正相關(guān)（r＝0.68，P＜0.05）。MVD 和HCC病理特征的關(guān)系見(jiàn)表2。HCC中腫瘤直徑＞5 cm、有包膜浸潤(rùn)、Edmondson－Steiner分級(jí)為Ⅲ～Ⅳ、出現(xiàn)轉(zhuǎn)移者，其MVD 均分別大于腫瘤直徑≤5cm、無(wú)包膜浸潤(rùn)、Edmondson－Steiner分級(jí)為Ⅰ～Ⅱ級(jí)及無(wú)轉(zhuǎn)移者（均P＜0.05）。而MVD 在AFP是否陽(yáng)性者以及是否肝硬化者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)CD34著色示HCC組織微血管（SP法，×200）Fig.4 Immunohistochemical staining of endothelial cells with CD34in HCC（SP，×200）

表2 MVD與HCC臨床病理特征之間的關(guān)系Table 2 Correlation of MVD with clinicopathological features in HCC

3 討論

一直以來(lái)，大家在腫瘤研究中只關(guān)注于腫瘤細(xì)胞的研究，而忽略了細(xì)胞外基質(zhì)的重要性，而基質(zhì)細(xì)胞及其產(chǎn)物在復(fù)雜的腫瘤生物學(xué)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起著重要作用［20］。腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，不僅取決于腫瘤細(xì)胞本身，而且與細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用而產(chǎn)生的復(fù)雜改變有關(guān)。腫瘤內(nèi)部及外周的細(xì)胞外基質(zhì)與正常組織的細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)關(guān)鍵分子功能的上調(diào)、下調(diào)影響明顯不同［21］。具有上述調(diào)節(jié)功能的Tenascin－C分子，能夠通過(guò)影響細(xì)胞間的相互作用促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和生長(zhǎng)［22］。盡管已經(jīng)證實(shí)很多腫瘤表達(dá)Tenascin－C［23－25］，但是對(duì)Tenascin－C 在HCC 內(nèi)表達(dá)，及其對(duì)HCC 浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和血管生成等的影響了解并不多。

如同其他惡性腫瘤內(nèi)一樣［26－27］，免疫組織化學(xué)和RT－PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示Tenascin－C 在HCC內(nèi)高表達(dá)，而正常組織中未見(jiàn)Tenascin－C 表達(dá)。在胚胎發(fā)育時(shí)期時(shí)常見(jiàn)到Tenascin－C 高表達(dá)，在成熟組織中Tenascin－C表達(dá)很少，但是在惡性腫瘤的基質(zhì)中卻發(fā)現(xiàn)有大量Tenascin－C 表達(dá)。研究表明腫瘤組織中的Tenascin－C由間質(zhì)成纖維細(xì)胞合成，且在局部腫瘤播散和旁分泌作用上起著至關(guān)重要作用［3，28］。進(jìn)一步研究Tenascin－C 和HCC 臨床病理特征之間的聯(lián)系發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)與HCC 病理學(xué)分級(jí)，腫瘤轉(zhuǎn)移和胞膜浸潤(rùn)之間存在相關(guān)性。進(jìn)展越快的腫瘤，Tenascin－C 的表達(dá)越高。我們觀察到Tenascin－C表達(dá)呈陰性患者較Tenascin－C 表達(dá)呈陽(yáng)性患者的預(yù)后明顯要好，這提示Tenascin－C 可作為預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后的因素。

在腫瘤中Tenascin－C 的作用仍未得到明確且存在很大爭(zhēng)議。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明Tenascin－C 通過(guò)增強(qiáng)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的有絲分裂效應(yīng)而促使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。其中，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子是誘導(dǎo)表皮生長(zhǎng)因子增殖的先決條件［22］。體外實(shí)驗(yàn)表明Tenascin－C 能夠抑制T 細(xì)胞活化，推測(cè)Tenascin－C可以促進(jìn)腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制和助腫瘤逃脫T 細(xì)胞作用［29］。然而，其他一些報(bào)道認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)中Tenascin－C 表達(dá)量增加將阻礙腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)［30］。本研究發(fā)現(xiàn)在HCC 癌巢邊緣Tenascin－C表達(dá)較強(qiáng)；癌浸潤(rùn)處Tenascin－C 較癌巢中心明顯要高。HCC 邊緣高表達(dá)的Tenascin－C 是否能誘發(fā)或抑制HCC生長(zhǎng)仍需要進(jìn)一步研究。

血管生成是指原血管長(zhǎng)出的新生毛細(xì)血管，其對(duì)于除微小型之外的腫瘤生長(zhǎng)至關(guān)重要。HCC 是血供豐富的腫瘤。已經(jīng)證實(shí)血管生成對(duì)于HCC 轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)具有重要的作用［17］。MVD 目前被認(rèn)為是腫瘤血管生成程度組織學(xué)評(píng)估的金標(biāo)準(zhǔn)。MVD 是一個(gè)預(yù)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和發(fā)展的獨(dú)立指標(biāo)。早先進(jìn)行的一些實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MVD 與腫瘤大小以及分化程度密切相關(guān)［31－32］。在本研究中發(fā)現(xiàn)MVD 與腫瘤大小和HCC 的Edmondson－Steiner分級(jí)有顯著的關(guān)系。此外，發(fā)現(xiàn)MVD 與HCC轉(zhuǎn)移和包膜侵犯相關(guān)，并且證實(shí)了血管生成對(duì)于HCC 進(jìn)展的重要性。在一些惡性腫瘤中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Tenascin－C 對(duì)其血管生成存在影響［33－34］。本研究發(fā)現(xiàn)在HCC 中存在Tenascin－C 表達(dá)，在癌巢和腫瘤浸潤(rùn)處存在的MVD 最高。在HCC 中Tenascin－C（＋）區(qū)域微血管數(shù)目明顯增多，這就意味著血管生成和HCC 中Tenascin－C表達(dá)有明顯關(guān)系存在。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證實(shí)Tenascin－C 能調(diào)節(jié)基質(zhì)中內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）［35－36］。Tanaka等［35］在實(shí)行癌細(xì)胞移植以及共同培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)Tenascin－C 能趨化一些調(diào)節(jié)因子誘導(dǎo)癌細(xì)胞產(chǎn)生VEGF。我們推測(cè)在Tenascin－C表達(dá)和腫瘤血管生成之間存在起著重要調(diào)節(jié)作用的因子，因而需要進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Tenascin－C 與腫瘤HCC 的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和血管生成密切相關(guān)。Tenascin－C 和MVD 可以作為預(yù)測(cè)HCC 轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)潛能的生物學(xué)指標(biāo)。

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