劉雙林， 王志華， 胡志全△， 曾 星， 李有元， 李 恒， 章傳華， 葉章群

1 武漢市第一醫(yī)院泌尿外科，武漢 430022

2 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科，武漢 430030

姜黃素是從中藥姜黃的根莖中提取出來(lái)的一種脂溶性酚類(lèi)色素，藥用歷史悠久。姜黃素可在體內(nèi)、外抑制腫瘤的增殖并誘導(dǎo)凋亡，并可通過(guò)抑制血管生成達(dá)到抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的目的。姜黃素可能通過(guò)多條信號(hào)通路和調(diào)節(jié)相關(guān)腫瘤因子在體外抑制激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡。最近文獻(xiàn)報(bào)道，姜黃素具有鐵螯合活性，能夠上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）的表達(dá)水平［1］。姜黃素一方面競(jìng)爭(zhēng)性地與細(xì)胞外鐵離子結(jié)合，降低胞外游離鐵的水平；另一方面，姜黃素通過(guò)上調(diào)TfR 的表達(dá)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵的利用，促進(jìn)了腫瘤增殖，從而影響了它的抗瘤效應(yīng)［2］。因此，在應(yīng)用姜黃素同時(shí)，選用拮抗TfR 的制劑能否發(fā)揮協(xié)同抗瘤效應(yīng)值得探索。本課題組擬研究姜黃素聯(lián)合抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白受體單克隆抗體（TfR mAb）對(duì)激素非依賴性前列腺癌的抑制作用，為姜黃素和抗人TfR mAb的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C－3由武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物保藏中心提供；DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司；姜黃素、二甲基亞砜（DMSO）、CFSE和碘化丙啶（PI）均購(gòu)自Sigma公司。AnnexinⅤ－FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。姜黃素用DMSO 配制為50 mmol／L儲(chǔ)備液，－20℃保存，使用時(shí)用DMEM 培養(yǎng)液稀釋至所需濃度，確保DMSO 的終濃度低于0.1%?？谷薚fR mAb 由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系沈關(guān)心教授饋贈(zèng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C－3 細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)，每3～4d 傳代1 次。實(shí)驗(yàn)分4 組：抗人TfR mAb組加入100mg／L的抗人TfR mAb溶液進(jìn)行干預(yù)，聯(lián)合作用組加入100 mg／L 的抗人TfR mAb和50μmol／L的姜黃素聯(lián)合作用，不加入藥物為空白對(duì)照組（0μmol／L），同時(shí)設(shè)含0.1%DMSO的DMEM 為陰性對(duì)照組。

1.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期腫瘤細(xì)胞，用PBS液洗滌2次后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×109個(gè)／L，取1 mL 加入1 μL CFSE（終濃度為1μmol／L）置于37℃孵育30 min。加入1mL小牛血清終止染色，再用PBS洗滌3次后接種于24孔培養(yǎng)板中（5×104／孔）。并預(yù)留部分染色后的細(xì)胞作為母代細(xì)胞，40g／L 多聚甲醛固定后4℃避光保存，待上機(jī)。待細(xì)胞貼壁后按實(shí)驗(yàn)分組分別加藥干預(yù)，重復(fù)3孔。作用24h后，收集各組細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4 細(xì)胞周期檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板（5×104／孔），待細(xì)胞貼壁后按實(shí)驗(yàn)分組分別加藥干預(yù)，重復(fù)3孔。作用24h后，收集各組細(xì)胞。用PBS液洗滌2 次后，加入預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞4℃過(guò)夜。檢測(cè)前用PBS液洗去固定液，加入0.15 mL的PI綜合染液（含50g／L RNA 酶），避光染色30min后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于24 孔培養(yǎng)板中（5×104／孔），待細(xì)胞貼壁后按實(shí)驗(yàn)分組分別加藥干預(yù)，重復(fù)3 孔。作用24h 后，收集各組細(xì)胞。用PBS液洗滌2次后，按Annexin Ⅴ－FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞表面TfR 表達(dá)檢測(cè)

以3×105／孔細(xì)胞密度將PC－3 細(xì)胞種入6 孔板，常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)第2天加入不同濃度的姜黃素進(jìn)行干預(yù)，重復(fù)3 孔。24h 后棄上清，用PBS 洗2次，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞，再用PBS離心洗滌3次。取單個(gè)細(xì)胞懸液加入FITC標(biāo)記的鼠抗人TfR mAb，4℃避光孵育30 min，加入PBS 洗滌細(xì)胞1次。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，記錄平均熒光強(qiáng)度。

1.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 抗人TfR mAb對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

如圖1～3所示，陰性對(duì)照組與抗人TfR mAb作用組的PC－3 細(xì)胞增殖指數(shù)分別為（7.08±0.20）和（7.38±0.19）（P＞0.05），凋亡率分別為（5.34±0.96）%和（4.53±0.87）%（P＞0.05），G2／M 期細(xì)胞比例分別為（34.27± 1.87）% 和（37.29±1.91）%（P＞0.05）。研究提示，抗人TfR mAb單獨(dú)作用對(duì)PC－3細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期無(wú)顯著影響。

2.2 姜黃素對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞表面TfR 表達(dá)的影響

50μmol／L姜黃素作用24h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞表面TfR 的平均熒光強(qiáng)度由（3 614.3±679.6）增高到（6 785.2±624.7）（P＜0.05）。研究顯示，姜黃素能夠顯著上調(diào)雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞表面TfR 的表達(dá)。見(jiàn)圖4。

圖1 抗人TfR mAb對(duì)PC－3 細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Anti－proliferative effects of TfR mAb on PC－3Cells

圖2 抗人TfR mAb對(duì)PC－3 細(xì)胞周期的影響Fig.2 The effect of TfR mAb on cell cycle

圖3 抗人TfR mAb對(duì)PC－3 細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 The effect of TfR mAb on apoptosis of PC－3cells

2.3 抗人TfR mAb增強(qiáng)姜黃素對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

圖4 姜黃素對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞表面TfR表達(dá)的影響Fig.4 The impacts of curcumin on the TfR expression in PC－3cells

與陰性對(duì)照組相比，50μmol／L 的姜黃素作用后，PC－3細(xì)胞的增殖指數(shù)明顯降低［（7.08±0.20）vs.（4.38±0.19），P ＜0.05］；凋亡率明顯提高［（5.34±0.96）%vs.（21.53±2.87）%，P＜0.05］；G2／M 期細(xì)胞比例明顯上升［（34.27±1.87）%vs.（57.29±1.91）%，P＜0.05］。加入抗人TfR mAb聯(lián)合作用后，姜黃素對(duì)PC－3細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響無(wú)顯著變化（P＞0.05），對(duì)PC－3細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)效應(yīng)顯著增強(qiáng)（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 抗人TfR mAb增強(qiáng)姜黃素對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用Fig.5 Apoptosis－inducing effects of TfR mAb in combination with curcumin on PC－3cells

3 討論

鐵是每個(gè)有機(jī)體必需的基本物質(zhì)，組織細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育都需要鐵的參與。在脊椎動(dòng)物中主要通過(guò)轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）和TfR 來(lái)攝取有活性的鐵離子，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)。組織細(xì)胞攝取鐵是通過(guò)細(xì)胞表面的TfR 介導(dǎo)，以胞吞模式進(jìn)行，即攜帶鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白與細(xì)胞表面的TfR 結(jié)合形成Tf－TfR 復(fù)合體，以胞飲內(nèi)吞形式進(jìn)入細(xì)胞，當(dāng)胞內(nèi)pH 值降低時(shí)鐵被釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，而Tf－TfR 復(fù)合體經(jīng)胞吐作用重返細(xì)胞表面［3］。TfR 是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，是由2個(gè)同源二聚體通過(guò)2條二硫鍵交聯(lián)而成，廣泛表達(dá)于機(jī)體多種細(xì)胞，其表達(dá)主要是根據(jù)細(xì)胞內(nèi)鐵水平進(jìn)行調(diào)節(jié)［4］。所有的正常細(xì)胞都有低水平的TfR表達(dá)，腫瘤細(xì)胞因增殖較快對(duì)鐵的需求量增加，其表面TfR 穩(wěn)定性高表達(dá)，是腫瘤生物治療的特異性靶點(diǎn)。有學(xué)者使用微陣列技術(shù)研究了TfR 在41株人惡性腫瘤細(xì)胞系（包括結(jié)腸癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、白血病、腎癌和前列腺癌等）中的表達(dá)情況，研究發(fā)現(xiàn)TfR 在激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著高于其它腫瘤細(xì)胞系［5］。研究結(jié)果提示，TfR 是激素非依賴性前列腺癌生物治療的理想靶點(diǎn)?？谷薚fR mAb可以特異性識(shí)別人腫瘤細(xì)胞表面TfR 胞外端，且具有較高的親合力，是較好的腫瘤靶向治療制劑，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

TfR mAb在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用的主要機(jī)制包括：①封閉轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子的通道，使細(xì)胞內(nèi)與增殖相關(guān)的DNA 和蛋白合成功能下降；②通過(guò)抑制胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)，引起細(xì)胞膜電興奮的傳導(dǎo)障礙，使細(xì)胞功能紊亂；③抗體封閉細(xì)胞表面受體，干擾生長(zhǎng)信號(hào)傳遞，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡機(jī)制［6－8］。此外，TfR mAb還可以提高化療藥物的敏感性，存在一定的協(xié)同抗瘤作用［9］。但是，TfR mAb 單獨(dú)作用只能抑制70%左右鐵的攝取，并不能完全阻斷鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)。由于腫瘤細(xì)胞的鐵庫(kù)（iron pool）內(nèi)都有一定量的鐵儲(chǔ)備，導(dǎo)致TfR mAb單獨(dú)作用對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為影響有限［10］。本研究顯示，抗人TfR mAb單獨(dú)作用對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為無(wú)顯著影響。

姜黃素是從中藥姜黃的根莖中提取出來(lái)的一種脂溶性酚類(lèi)色素，藥用歷史悠久。姜黃素可在體內(nèi)、外抑制腫瘤的增殖并誘導(dǎo)凋亡，并可通過(guò)抑制血管生成達(dá)到抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的目的［11－12］。姜黃素可能通過(guò)多條信號(hào)通路和調(diào)節(jié)相關(guān)腫瘤因子在體外抑制激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡［13－15］。有文獻(xiàn)報(bào)道，姜黃素具有鐵螯合活性，能夠上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面TfR 的表達(dá)水平。姜黃素一方面競(jìng)爭(zhēng)性地與細(xì)胞外鐵離子結(jié)合，降低胞外游離鐵的水平；另一方面，姜黃素通過(guò)上調(diào)TfR 的表達(dá)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵的利用，促進(jìn)了腫瘤增殖，從而影響了它的抗瘤效應(yīng)［16］。本研究亦證實(shí)，姜黃素可導(dǎo)致雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞表面TfR 表達(dá)增高。因此，在應(yīng)用姜黃素同時(shí)，選用拮抗TfR 的制劑可能發(fā)揮協(xié)同抗瘤效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，抗人TfR mAb可以增強(qiáng)姜黃素誘導(dǎo)雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞凋亡的作用。

本研究提示，應(yīng)用抗人TfR mAb 可以增強(qiáng)姜黃素對(duì)雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)，為姜黃素和抗人TfR mAb的聯(lián)合應(yīng)用提供了理論依據(jù)。抗人TfR mAb可以增強(qiáng)姜黃素抗瘤效應(yīng)的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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