孔 曼， 陳 娟， 周 潔， 朱文德， 萬麗敏， 熊宇芳， 李子希

1 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，武漢 430030

2 武漢市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430014

3 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430070

研究表明，心肌細(xì)胞凋亡可參與多種心血管疾病的發(fā)生過程，如冠心病、心絞痛、心力衰竭、心肌炎及心臟自身免疫性疾病等［1］。Hamada等［2］研究發(fā)現(xiàn)大鼠腹主動脈狹窄所致的持續(xù)性壓力負(fù)荷升高可加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR），誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）相關(guān)的細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病和心力衰竭。在多種致心肌損傷因素的持續(xù)作用下，可引起過度ERS，通過CHOP（C／EBP homologous protein）、應(yīng)激活化蛋白激酶和Caspase－12等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑相關(guān)信號分子引起細(xì)胞凋亡［3］?；谏鲜鲅芯?，我們擬通過觀察過氧化氫（H2O2）對體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，探討其可能的信號通路是否與觸發(fā)ERS調(diào)控機(jī)制有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞株為乳鼠心肌細(xì)胞（H9C2），來源于上海細(xì)胞典藏中心。DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清由美國Gibco公司提供，伊紅和蘇木精、碘化丙啶溶液（PI）均購自Sigma 公司。實(shí)驗(yàn)中所用抗體購自美國Santa Cruz公司。H2O2購自于北京宏盛苑化工有限公司，為分析純產(chǎn)品。Annexin Ⅴ－FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、活性Caspase－12 和活性Caspase－3檢測試劑盒購自凱基生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存的H9C2細(xì)胞，迅速放入37℃水浴箱中直至融解；放入培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，12h 后換新鮮的培養(yǎng)液；每2～3天傳1代，1∶2的比例傳代。

1.2.2 細(xì)胞行蘇木精－伊紅染色 按照實(shí)驗(yàn)分組鋪6孔板，待細(xì)胞密度為80%，吸棄上清液，加1 mL 95%乙醇固定40min，加蘇木精600μL染核15min，自來水洗后加0.1%鹽酸乙醇，分化10～30s，溫水返藍(lán)后再加伊紅10min，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)測細(xì)胞凋亡率 使用AnnexinⅤ－FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，按照使用說明通過檢測膜磷脂酰絲氨酸（PS）評估細(xì)胞凋亡。用不含EDTA 的0.25%胰酶液消化重懸細(xì)胞，2 000r／min離心5min，棄上清，PBS洗2次，收集（1～5）×105個細(xì)胞；加入500μL 的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，隨后加入5μL AnnexinⅤ－FITC混勻，再加入5μL PI染液混勻，室溫避光反應(yīng)5～15min，于1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量檢測。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測Caspase－12、Caspase－3 的活化 使用活性Caspase－12和活性Caspase－3檢測試劑盒，按照使用說明檢測活性Caspase－12和活性Caspase－3的熒光強(qiáng)度。用不含EDTA 的胰酶消化收集細(xì)胞，每管用0.5mL的BD Cytofix／Cytoperm（1×）溶液重懸細(xì)胞，冰置20 min后用0.5 mL 的BD Perm／wash buffer（1×）洗2 遍，加入100μL BD Perm／wash buffer（1×）＋20μL 活性Caspase－12和Caspase－3的抗體室溫避光放置30min，離心棄上清，再用1.0 mL BD Perm／wash buffer（1×）洗1 遍后，加入0.2 mL BD Perm／wash buffer（1×）重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞提取蛋白，用BCA 法測得蛋白濃度。取樣品蛋白質(zhì)100μg，SDS－PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)到NC 膜上，然后用5%的脫脂奶粉封閉2h，加入一抗（稀釋度：兔抗p－PERK 和CHOP多克隆抗體1∶400；羊抗p－JNK 多克隆抗體1∶400；鼠抗β－actin單克隆抗體1∶10 000）室溫下?lián)u動孵育2h或4℃過夜，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗后顯影。掃描后定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 H2O2 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用

我們采用100μmol／L（低濃度）和500μmol／L（高濃度）的H2O2，對心肌細(xì)胞給予不同時間（0、4、8、12、24h）的刺激，用流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示：100μmol／L H2O2可顯著誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率明顯高于500μmol／L（P＜0.01），且細(xì)胞凋亡率在8h達(dá)到高峰，隨后細(xì)胞壞死率逐漸增加。500μmol／L H2O2處理組雖然有一定的細(xì)胞凋亡率，但壞死細(xì)胞比例顯著上調(diào)（圖1）。

2.2 H2O2 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化

如圖2所示，正常組心肌細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞與細(xì)胞間排列緊密；100μmol／L H2O2處理組的心肌細(xì)胞呈皺縮變形，500μmol／L H2O2處理組心肌細(xì)胞失去原有形態(tài)，質(zhì)膜腫脹溶解壞死。

2.3 H2O2 對ERS標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，為進(jìn)一步探討H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的可能信號途徑，我們采用Western blot檢測ERS標(biāo)志蛋白p－PERK 和CHOP 的表達(dá)水平。采用低濃度H2O2（100μmol／L）處理不同時間的心肌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，未處理組作為對照組，與藥物孵育后提取蛋白樣品進(jìn)行Western blot分析。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測H2O2 對心肌細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 Flow cytometry analyses of cell apoptosis induced by H2O2

圖2 不同濃度H2O2 刺激8h后心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化（蘇木精－伊紅染色，×40）Fig.2 The morphological changes of myocardial cells induced by H2O2for 8h（HE staining，×40）

結(jié)果顯示：在上樣量一致的情況下，不同時間點(diǎn)H2O2處理組p－PERK 和CHOP 蛋白表達(dá)依次增高，至8h達(dá)到高峰，12h和24hCHOP蛋白的表達(dá)量與8h時間點(diǎn)相比則分別下調(diào)了48%和49%，12h和24hp－PERK 蛋白的表達(dá)量與8h時間點(diǎn)相比則分別下調(diào)了30%和40%。提示：H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡與ERS有關(guān)，且在8h作用時間點(diǎn)達(dá)到高峰。

圖3 H2O2（100μmol／L）處理不同時間心肌細(xì)胞ERS標(biāo)志蛋白的表達(dá)Fig.3 The expression of ERS marker proteins induced by H2O2（100μmol／L）in myocardial cells

2.4 化學(xué)伴侶PBA（4－phenylbutyric acid）對H2O2 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響

由于ERS的誘因之一是錯誤或未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的聚集，而化學(xué)伴侶可以使錯誤或未折疊蛋白進(jìn)行正確折疊，因此，化學(xué)伴侶PBA 是ERS抑制劑。我們將心肌細(xì)胞分為4組，即未處理組、PBA（500μmol／L）處理12h組、H2O2（100μmol／L）處理8h組、PBA（500μmol／L）預(yù)處理12h＋H2O2（100μmol／L）處理8h組。為進(jìn)一步探討其機(jī)制，我們采用Western blot檢測與ERS相關(guān)的凋亡信號分子p－JNK 等的蛋白表達(dá)水平，采用流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記的活化的Caspase－3 和Caspase－12。結(jié)果表明：PBA 預(yù)處理后可顯著逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的p－JNK、p－PERK、CHOP的表達(dá)上調(diào)；使活化的Caspase－3和Caspase－12的含量顯著減少（P＜0.01），即ERS抑制劑PBA 可顯著逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡（圖4、5）。

圖4 PBA 對H2O2 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞p－PERK、CHOP、p－JNK 蛋白表達(dá)的影響Fig.4 The effect of PBA on the expression of ERS marker proteins induced by H2O2in myocardial cells

圖5 PBA 對H2O2 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Caspase－3和Caspase－12活化的影響Fig.5 The effect of PBA on the activation of Caspase－3 and Caspase－12induced by H2O2in myocardial cells

3 討論

大量研究表明氧化應(yīng)激在心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中有重要作用。近年來研究顯示：氧化應(yīng)激與內(nèi)皮功能障礙等病理生理機(jī)制相互作用，共同促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。Lennon等［4］首先發(fā)現(xiàn)低濃度的H2O2（10～100μmol／L）可誘導(dǎo)HL－60 細(xì)胞發(fā)生凋亡，而當(dāng)H2O2濃度繼續(xù)升高時，便可導(dǎo)致大量的細(xì)胞壞死。此后，對氧化應(yīng)激介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)行了大量的研究，發(fā)現(xiàn)H2O2或O－2等外源性活性氧均可誘導(dǎo)培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞凋亡，同時，由于細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)受損而導(dǎo)致的內(nèi)源性活性氧生成增加亦可介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡［5］。這些研究結(jié)果均表明：氧化應(yīng)激是心肌細(xì)胞凋亡的重要誘導(dǎo)因素。在本實(shí)驗(yàn)中，我們的結(jié)果顯示高濃度的H2O2對細(xì)胞的作用是導(dǎo)致細(xì)胞壞死，而低濃度的H2O2導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致。

ERS是由于某種原因?qū)е录?xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡、生理功能發(fā)生紊亂的一種亞細(xì)胞器的病理過程［6］。研究表明：ERS反應(yīng)是細(xì)胞的一種自我保護(hù)性機(jī)制，以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，維持細(xì)胞生存，但是過強(qiáng)的或長時間的ERS 反應(yīng)可以引起細(xì)胞凋亡［7］。越來越多的研究證實(shí)，ERS與心血管疾病的發(fā)生關(guān)系密切。

Zhao等［8］在小鼠缺血缺氧細(xì)胞模型中證實(shí)有活性氧的產(chǎn)生，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵對氧化損傷敏感，因此認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可能是活性氧攻擊的重要目標(biāo)之一。ERS的早期主要是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子GRP78、GRP94、CRT 表達(dá)上調(diào)和PERK－eIF2α磷酸化介導(dǎo)的蛋白合成暫停［9］。因此，心肌缺血早期和心肌肥大代償階段主要出現(xiàn)GRP78、CRT 表達(dá)和PERK、eIF2α磷酸化的上調(diào)，表明細(xì)胞通過ERS 調(diào)節(jié)自穩(wěn)態(tài)失衡，過強(qiáng)和持續(xù)的ERS可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡途徑引起細(xì)胞凋亡［9］。近年來PERK 在ERS中的作用受到關(guān)注，PERK 磷酸化激活后，早期可抑制蛋白合成，晚期則可上調(diào)CHOP的表達(dá)，活化ERS相關(guān)凋亡信號途徑。

高表達(dá)的CHOP通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax、下調(diào)Bcl－2表達(dá)，促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素C 釋放、凋亡小體形成和Caspases活化從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［10］。我們發(fā)現(xiàn)，低濃度H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞p－PERK 和CHOP表達(dá)顯著上調(diào)。推測：低濃度H2O2作用8h后引起心肌細(xì)胞過度ERS，通過CHOP、p－PERK等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡途徑引起細(xì)胞凋亡。

Caspase－12存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，ERS 可引起Caspase－12活化，另外IRE1 與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（tumor necrosis factor receptor－associated factor 2，TRAF2）結(jié)合啟動JNK 級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)Caspase－12在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上聚集與活化，Caspase－12通過激活Caspase－9、Caspase－3 而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11－12］，其活化過程可不涉及細(xì)胞色素C 從線粒體釋放，表明Caspase－12通過不同于線粒體凋亡途徑的獨(dú)立信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的p－JNK、p－PERK、CHOP 高表達(dá)，活化Caspase－3 和Caspase－12，加入ERS的抑制劑PBA 后，心肌細(xì)胞的凋亡率顯著下調(diào)，Western blot檢測結(jié)果顯示p－JNK、p－PERK、CHOP的表達(dá)也顯著降低。由此證實(shí)：氧化應(yīng)激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡與促發(fā)ERS有關(guān)。我們推論：ERS途徑可能是H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。

綜上所述，我們的研究結(jié)果證實(shí)低濃度的H2O2可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，高濃度的H2O2則導(dǎo)致細(xì)胞壞死，ERS的抑制劑PBA 可部分抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑可能是H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。

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