劉美琴， 周 珺， 馬 亮， 國 風(fēng)

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州215006)

乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑(mammary serine protease inhibitor，maspin)是絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)超家族中的一個(gè)獨(dú)特成員［1］。maspin 表達(dá)的臨床意義受制于遺傳背景、組織類型和基礎(chǔ)表達(dá)水平等因素［2］。在包括前列腺癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤中，maspin 被認(rèn)為是一個(gè)抑癌基因。本研究中，我們通過RNA 干擾技術(shù)并建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系來探討maspin 如何影響前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。

材 料 和 方 法

1 主要試劑、抗體和儀器

RPMI－1640 購自Gibco－BRL;胎牛血清購自杭州四季青公司;限制性內(nèi)切酶Hpa I 和Xho l 購自NEB;質(zhì)粒小抽和大抽試劑盒購自O(shè)mega;SyberGreen Mix 購自美季公司;M－MLV 購自Invitrogen;轉(zhuǎn)染試劑Fugene HD 和蛋白酶抑制劑購自Roche;maspin 抗體(554292)購自BD Bioscience;RelA(sc－8008)和RelB(sc－226)抗體購自Santa Cruz Biotechnology;β－actin 抗體(AA128)購自碧云天公司;熒光Ⅱ抗購自Li－cor;MG－132 購自Sigma;流式細(xì)胞儀FACSCalibur 購自BD Bioscience;熒光倒置顯微鏡購自O(shè)lympus;NanoDrop 購自Thermo;LightCycler? 480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀和xCELLigence 系統(tǒng)購自Roche;Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)購自LI－COR。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞株DU145 和PC－3 細(xì)胞為我實(shí)驗(yàn)室長期保存，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的RPMI－1640完全培養(yǎng)體系中，在37℃、5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。包裝細(xì)胞Phoenix A(由中科院動物所趙勇教授贈送)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 完全培養(yǎng)體系中。應(yīng)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，2 ～3 d 傳代1 次，選用對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 Maspin－shRNA 的設(shè)計(jì)和表達(dá)載體的構(gòu)建

按shRNA 靶序列的設(shè)計(jì)原則，針對maspin 基因的靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)RNA 干擾片段，具體為1 171－1 189位(5’－ GCACAAGGATGAATTGAAT－3’)并在Invitrogen 公司合成。將慢病毒載體pLL3.7(中科院動物所趙勇教授贈送)用Hpa I 和Xho l 酶切并去磷酸化，然后將合成的shRNA 正鏈和負(fù)鏈退火并連接至pLL3.7 載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α 大腸桿菌中，質(zhì)粒小量抽提鑒定后進(jìn)一步測序鑒定(華大基因公司)，鑒定好的載體質(zhì)粒采用試劑盒大量制備。

4 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染maspin－shRNA 細(xì)胞系

接種0.5 ×106Phoenix A 細(xì)胞至35 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞生長至70%～80%融合度時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑為Fugene FD，具體操作如說明書。包裝載體為pCMV－VSV－G 和pCMV－dR8.9，與制備好的pLL3.7－shRNA 質(zhì)粒(pLL3.7－siMaspin 或pLL3.7－control)共轉(zhuǎn)染。pLL3.7－control 為實(shí)驗(yàn)陰性對照(non－silencing siRNA)。轉(zhuǎn)染18 h 后熒光顯微鏡下觀察GFP 信號并更換新鮮的DMEM 完全培養(yǎng)基。48 h 后，1 500 r/min 離心獲得含有病毒顆粒的上清，用0.45 μm 的濾器過濾除去細(xì)胞碎片等雜質(zhì)。將病毒上清和目的細(xì)胞(PC－3)混勻，培養(yǎng)48 h 后，用極限稀釋細(xì)胞克隆形成法得到單克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

5 實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR(qRT－PCR)

Trizol 一步法抽提細(xì)胞總RNA 并用NanoDrop 定量。取2 μg RNA 參照M－MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶操作說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qRT－PCR 反應(yīng)在LightCycler?480 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上完成。每個(gè)反應(yīng)均設(shè)3 復(fù)孔，反應(yīng)共40 次循環(huán)。以β－actin 作為內(nèi)參照，檢測每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(即Ct 值)，mRNA 的相對表達(dá)水平用2－ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。引物設(shè)計(jì)使用Primer－BLAST 軟件(NCBI)。

6 全蛋白提取

將5 ×106細(xì)胞用預(yù)冷的PBS 洗1 次，快速加入3 ～5 倍體積的緩沖液，再加入同體積的2 ×十二烷基硫酸鈉凝膠上樣緩沖液。95 ℃加熱10 min 后立即置于冰上，用1 mL 注射器反復(fù)抽吸約20 次，室溫，10 000 r/min 離心10 min，轉(zhuǎn)移上清置－80 ℃冰箱保存。

7 Western blotting 法檢測蛋白的表達(dá)

細(xì)胞裂解液，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h 后，加入I 抗于4 ℃孵育過夜。熒光標(biāo)記的II 抗(1∶2 000 稀釋)2 h 室溫孵育，PBST(含1%Tween 的PBS)洗膜，用Odyssey 紅外熒光掃描成像系統(tǒng)檢測待測蛋白。

8 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析

使用xCELLigence 系統(tǒng) 與RTCA 1.2 軟件進(jìn)行細(xì)胞指數(shù)(cell index，CI)測定，并于E－Plate 16 中進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測?！凹?xì)胞指數(shù)”是由測得的電阻抗(electrical impedance)頻譜推得的一種無量綱參數(shù)，其數(shù)值反映細(xì)胞數(shù)目(活細(xì)胞或貼附細(xì)胞數(shù)目)。無細(xì)胞狀態(tài)下，加樣孔(E－Plate 16)底部排列的微電極陣列的阻抗分布近似均勻;加入細(xì)胞后，細(xì)胞與電極表面接觸，影響電極和溶液間離子環(huán)境，導(dǎo)致電阻抗升高。細(xì)胞越多電阻抗增加越多，即細(xì)胞指數(shù)值越高。用100 μL 含10% FCS 的RPMI－1640 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的背景電阻抗檢測。每孔體積調(diào)為100 μL，密度為3 000 個(gè)細(xì)胞。接種后，電阻抗以固定時(shí)間間隔被測定，對細(xì)胞持續(xù)監(jiān)測5 d。

9 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞死亡

收集0.5 ×106個(gè)細(xì)胞，用流式緩沖液洗1 次，加入碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液50 μL，室溫下避光孵育5 min，用流式緩沖液洗滌后，將細(xì)胞重懸于300 μL 的流式緩沖液中，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行t 檢驗(yàn)或細(xì)胞死亡檢測。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞株中maspin 的表達(dá)

以β－ actin 為對照，通過Western blotting 法檢測了雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞株DU145 和PC－3 細(xì)胞中maspin 的表達(dá)情況。DU145 細(xì)胞中maspin 的蛋白表達(dá)較低，而PC－3 細(xì)胞中maspin 的蛋白表達(dá)顯著高于前者，見圖1，故選用PC－3 細(xì)胞進(jìn)行靶向沉默maspin 的實(shí)驗(yàn)。

Figure 1. The expression of maspin in DU145 and PC－3 prostatic cancer cells. ±s.n=4. * P ＜0.05 vs DU145.圖1 前列腺癌DU145 和PC－3 細(xì)胞中maspin 的表達(dá)

2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染maspin－shRNA 細(xì)胞系的建立與鑒定

采用極限稀釋細(xì)胞克隆形成法分別得到單克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞PC－3－siMaspin1 和PC－3－siMaspin2，熒光實(shí)時(shí)定量qRT－PCR 法檢測結(jié)果顯示PC－3－siMaspin1 和PC－3－siMaspin2 細(xì)胞的maspin mRNA表達(dá)水平相比較PC－3－control 細(xì)胞有明顯變化，約呈4 倍下降，見圖2A。

Western blotting 法檢測結(jié)果顯示，PC－3－si-Maspin1 和PC－3－siMaspin2 細(xì)胞系的maspin 蛋白表達(dá)水平顯著低于PC－3－control 細(xì)胞組，分別降低4 倍和6.4 倍，見圖2B，故選用PC－3－siMaspin2 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 2. The expression of maspin in PC－3 cells after transfection with maspin－shRNA. A:qRT－PCR analysis of maspin mRNA expression in prostate cancer cells;B:Western blotting analysis of maspin protein expression in whole－cell extracts of prostate cancer cells. ±s.n=3. ＊＊ P ＜0.01 vs PC－3－control.圖2 maspin－shRNA 轉(zhuǎn)染PC－3 細(xì)胞對maspin mRNA 和蛋白表達(dá)水平的影響

通過普通倒置顯微鏡和熒光倒置顯微鏡觀察PC－3－siMaspin2 細(xì)胞，可見綠色熒光蛋白在細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá)，見圖3A。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測到綠色熒光蛋白在PC－3－siMaspin 2 細(xì)胞中的表達(dá)率可達(dá)到95.99%，見圖3B。

Figure 3. Detection of flurorescence signal and GFP expression in PC－3－siMaspin2 cells. A:PC－3－siMaspin2 cells were detected using fluorescence microscope. a:phase－contrast microscope;b:fluorescence microscope. B:flow cytometric analysis of GFP expression in PC－3－siMaspin2 cells and PC－3－control cells.圖3 Maspin－shRNA 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中熒光信號的觀察

3 Maspin 沉默對PC－3 細(xì)胞生長的影響

細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示PC－3－control 與PC－3－si-Maspin2 細(xì)胞在接種后的第1 d 生長相似，而在第3 d PC－3－siMaspin2 細(xì)胞生長明顯快于PC－3－control 細(xì)胞，見圖4A。通過xCELLigence 系統(tǒng)對5 d 生長過程的細(xì)胞指數(shù)進(jìn)行動態(tài)檢測，結(jié)果顯示，第1 d兩組細(xì)胞的生長速度相似(P ＞0.05)，第2 d 起PC－3－siMaspin2 細(xì)胞生長明顯快于PC－3－control細(xì)胞(P ＜0.05 或P ＜0.01)，見圖4B。PC－3－si-Maspin2 細(xì)胞的倍增時(shí)間為26.83 h，而PC－3－control 細(xì)胞的倍增時(shí)間為37.95 h。

4 Maspin 沉默對細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

qRT－PCR 結(jié)果顯示，抗凋亡基因(bcl－2 和A20)在PC－3－siMaspin2 細(xì)胞mRNA 表達(dá)水平較PC－3－control 細(xì)胞有不同程度升高;而促凋亡基因(bax 和bim)在PC－3－siMaspin2 細(xì)胞mRNA 表達(dá)水平較PC－3－control 細(xì)胞有不同程度降低，見圖5。

Figure 4. The effect of maspin silencing on cell growth and proliferation of PC－3 cells. A:growth curves of PC－3－control and PC－3－siMaspin2 cells. ±s. n =4. * P＜0.05 vs PC－3－control. B:the proliferation of PC－3－control and PC－3－siMaspin2 cells dynamically detected using xCELLigence system. ±s.n=3.圖4 Maspin 沉默對PC－3 細(xì)胞的生長和增殖的影響

Figure 5. The expresison of bcl－2，A20，bax，and bim mRNA in PC－3－control and PC－3－siMaspin2 cells analyzed by qRT－PCR. ±s. n =3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs PC－3－control.圖5 PC－3－control 和PC－3－siMaspin2 細(xì)胞bcl－2、A20、bax 和bim mRNA 的表達(dá)

5 蛋白酶體抑制劑對PC－3－siMaspin2 細(xì)胞的作用

應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG－132(1 μmol/L)處理PC－3－control 和PC－3－siMaspin2 細(xì)胞，采用PI染色法檢測細(xì)胞死亡率，未處理時(shí)細(xì)胞死亡率分別為9.2%±5.6%和3.8%±1.2%，MG－132 作用8 h細(xì)胞死亡率分別為27.1%±5.6%和7.5%±2.3%;作用24 h 細(xì)胞死亡率為24.2%±3.7%和8.2% ±2.5%，作用36 h 細(xì)胞死亡率為28. 7%±3. 7% 和7.6%±2.5%，見圖6A。故PC－3－siMaspin 2 細(xì)胞其自發(fā)性死亡率比PC－3－control 細(xì)胞低，在MG－132 作用后PC－3－control 細(xì)胞的死亡率呈時(shí)間依賴性上升，PC－3－siMaspin2 細(xì)胞的死亡率比PC－3－control 細(xì)胞顯著降低。xCELLigence 系統(tǒng)連續(xù)觀察細(xì)胞生長5 d，結(jié)果顯示PC－3－control 細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間增長而減少，而PC－3－siMaspin2 細(xì)胞數(shù)無明顯變化，見圖6B。

Figure 6. The effects of MG－132 treatment on the survival of PC－3－control and PC－3－siMaspin2 cells. A:PI－positive cells detected by flow cytometric analysis;B:the prolifertion of PC－3－control and PC－3－si-Maspin2 cells dynamically detected using xCELLigence system. ±s.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs PC－3－control.圖6 MG－132 對PC－3－control 和PC－3－siMaspin2 細(xì)胞的毒性作用

6 Maspin 基因沉默對蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)的NFκB 蛋白表達(dá)的影響

Western blotting 法檢測結(jié)果顯示，PC－3－control 細(xì)胞在MG－132(1 μmol/L)作用下RelA 的表達(dá)逐漸下調(diào)，而PC－3－siMaspin2 細(xì)胞中RelA 的表達(dá)無明顯變化。PC－3－control 和PC－3－siMaspin2細(xì)胞中RelB 的表達(dá)均無顯著變化，見圖7。

Figure 7. The effects of MG－132 treatment on the expression of RelA and RelB in PC－3－control and PC－3－si-Maspin2 cells. ±s.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs 0 h.圖7 MG－132 對PC－3－control 和PC－3－siMaspin2 細(xì)胞RelA 和RelB 蛋白表達(dá)的影響

討 論

Maspin 是1994 年用消減雜交(subtractive hybridization)技術(shù)對正常乳腺組織和乳腺癌組織進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)腫瘤抑制基因。Maspin 基因編碼產(chǎn)物為serpin 超家族中的一個(gè)獨(dú)特成員，定位和或分泌于細(xì)胞漿及細(xì)胞核內(nèi)［3］。最初的研究表明maspin 是一抑癌基因，可以通過促凋亡蛋白Bax 的介導(dǎo)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長［4］。Maspin 在不同腫瘤類型中表達(dá)意義不一，例如在乳腺癌、肝癌和肺鱗癌中maspin 的過表達(dá)預(yù)示預(yù)后良好［5］。原發(fā)性前列腺癌中maspin 的表達(dá)顯著下降，并與病理分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床表現(xiàn)相關(guān)，為預(yù)后較差的一個(gè)獨(dú)立因素［6］。本研究中我們利用慢病毒包裝系統(tǒng)建立了靶向沉默maspin 的PC－3 細(xì)胞系。利用xCELLigence 系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)細(xì)胞觀測，發(fā)現(xiàn)靶向沉默maspin 的PC－3 細(xì)胞相比對照細(xì)胞生長速度明顯加快，倍增時(shí)間明顯縮短。另外，maspin 表達(dá)的降低導(dǎo)致自發(fā)性凋亡率減少，與促凋亡基因(bax 和bim)mRNA 表達(dá)水平下調(diào)的同時(shí)抗凋亡基因(bcl－2 和A20)mRNA 表達(dá)水平上調(diào)具有相關(guān)性。以上結(jié)果均表明maspin 表達(dá)沉默賦予了雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C－3 更強(qiáng)的腫瘤性，即maspin 在PC－3 細(xì)胞中起到抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

核因子κB(NF－κB)家族成員包括RelA/p65、p50、RelB、p52 和c－Rel，在炎癥發(fā)生、細(xì)胞增殖與凋亡和腫瘤形成等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮作用［7］。以RelA－p50 二聚體為代表的經(jīng)典性NF－κB 的持續(xù)活化在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用并被認(rèn)為是前列腺癌的共同特點(diǎn)［8］。代表著非經(jīng)典通路活性的RelB 蛋白逐漸被證實(shí)與實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，包括乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌等［9］。RelB 作用于前列腺的癌變過程并賦予了前列腺癌細(xì)胞的輻照耐受，嚴(yán)重影響前列腺癌的療效［10－12］。最新研究認(rèn)為RelB 在maspin 的表達(dá)調(diào)控中起重要作用，但RelA并不影響maspin 蛋白的表達(dá)［13－14］。蛋白酶體抑制劑通過抑制NF－κB 依賴性的基因轉(zhuǎn)錄，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多發(fā)性骨髓瘤、套細(xì)胞淋巴瘤以及急性髓細(xì)胞白血病患者的治療。PC－3 細(xì)胞中NF－κB 呈持續(xù)性活化。當(dāng)PC－3 細(xì)胞受到蛋白酶體抑制劑MG－132 作用時(shí)，采用xCELLigence 系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測并結(jié)合PI 染色法觀察到細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間依賴性死亡并伴隨RelA 蛋白表達(dá)的下調(diào);而在maspin 沉默的PC－3細(xì)胞中并未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡，但細(xì)胞生長受到抑制，同時(shí)RelA 蛋白表達(dá)未發(fā)生明顯變化。RelB 蛋白的表達(dá)在對照和maspin 沉默的PC－3 細(xì)胞變化不顯著。以上結(jié)果均說明maspin 表達(dá)沉默賦予了PC－3 細(xì)胞對蛋白酶體抑制劑的耐藥性，并與RelA 的表達(dá)的變化直接相關(guān)。

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