胡 邦， 謝尚奎， 黃美近， 蔣 李， 彭 慧， 汪建平， 任東林△， 王 磊△

(1 中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院胃腸病研究所，廣東 廣州510655;2深圳市人民醫(yī)院普外科，廣東 深圳518035)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率快速增長，嚴(yán)重危害人類的健康。在全世界范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌已經(jīng)成為男性的第三大惡性腫瘤和女性的第二大惡性腫瘤，2008 年全球新增120萬結(jié)直腸癌患者，死于結(jié)直腸癌的人數(shù)約為608 700人次［1］。在我國，結(jié)直腸癌的發(fā)病率也已經(jīng)躍居為男性惡性腫瘤的第4 位和女性惡性腫瘤的第3位［2］。結(jié)直腸癌的預(yù)后和腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者的總體5 年生存率僅為12%左右，但早期結(jié)直腸癌的5 年生存率可達(dá)到90%［3］。目前臨床上對(duì)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的診斷方法主要包括:影像學(xué)檢查(CT、MRI 或PET -CT)、腹部超聲、術(shù)中的直接觸診和視診。但是這些傳統(tǒng)的檢查方法最大的缺陷是很難發(fā)現(xiàn)微小的轉(zhuǎn)移灶，如直徑1 cm以下的肝轉(zhuǎn)移灶［4］。因此，尋找到一種能夠早期診斷遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物對(duì)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的綜合治療是非常重要的。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen -activated protein kinase，MAPK)家族是一類高度保守的蘇氨酸/酪氨酸蛋白激酶，可通過嚴(yán)格的3 級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)(MAPKKK→MAPKK→MAPK)激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5(extracellular signal - regulated kinase 5，ERK5)是最新發(fā)現(xiàn)的MAPKs 家族中的一個(gè)重要的一級(jí)激酶，它通過Thr218/Tyr220 雙位點(diǎn)的磷酸化激活后進(jìn)一步激活下游的癌基因如:MEF2、c－fos、Fra－1、Sap－1、c－myc 和NF－κB［5］。近期研究發(fā)現(xiàn)，ERK5 通過促進(jìn)血管的形成和血管內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定對(duì)維持腫瘤的生長起重要作用［6-7］。ERK5 在前列腺癌［8］、乳腺癌［9］、口腔鱗狀細(xì)胞癌［10］、Hodgkin 淋巴瘤［11］以及惡性間皮瘤［12］中過度表達(dá)。但ERK5 在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況卻沒有報(bào)道。本研究通過免疫組化檢測ERK5蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況，并分析其與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)及預(yù)后的相關(guān)性，初步探討其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 病例資料 隨機(jī)收集中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院2000 ～2006 年結(jié)直腸病例組織石蠟標(biāo)本338 例，其中結(jié)直腸腺癌組織338 例、癌旁正常組織80 例(距離腫瘤邊緣5 cm 以上)。所有腫瘤組織標(biāo)本和癌旁正常黏膜組織通過HE 染色被證實(shí)。338 例腫瘤患者中，男性179 例，女性159 例;年齡19 ～91 歲，平均年齡59.07 歲。338 例結(jié)直腸癌病例中I 期病例46例，II 期病例145 例，III 期病例120 例，IV 期病例27例(按照2009 年國際抗癌聯(lián)盟制定的第7 版TNM分期標(biāo)準(zhǔn))。所有患者均未接受過術(shù)前放化療，臨床病理及隨訪資料包括性別、年齡、體重指數(shù)(dody mass index，BMI)、腫瘤位置、分化程度、TNM 分期［根據(jù)腫瘤(tumor，T)、淋巴結(jié)(nodes，N)和轉(zhuǎn)移(metastasis，M)情況的分類法］、以及5 年總的生存率情況。338 例患者中有27 例失訪，病人的臨床病理資料已發(fā)表［13］。

1.2 主要儀器及試劑 ALPHELYS 組織芯片制作儀;LeiCaRM2245 型切片機(jī);兔抗人ERK5 多克隆抗體(sc-5626，Santa Cruz);HRP -Peroxide -DAB 試劑盒(DACO)。

2 方法

2.1 制作組織芯片 組織芯片的制作方法在我們?cè)缦鹊奈墨I(xiàn)已介紹［14］。簡而言之，首先選擇所需結(jié)直腸癌病理存檔蠟塊，根據(jù)HE 切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，確定具有代表性的病變部位并標(biāo)記。每個(gè)標(biāo)本取2 個(gè)點(diǎn)，直徑1 mm，按照組織芯片制作儀操作流程，制成組織芯片蠟塊，每個(gè)芯片蠟塊含12 ×8 個(gè)點(diǎn)。將芯片蠟塊切片，厚度4 μm，裱于載玻片上。

2.2 免疫組織化學(xué)染色 采用SABC 免疫組織化學(xué)法染色，組織芯片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3%H2O2中消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，pH 6.0 的檸檬酸鈉溶液中微波抗原修復(fù)。滴加適量ERK5 抗體(濃度1∶200)4 ℃過夜，按DACO 試劑盒說明進(jìn)行染色，DAB 顯色和蘇木素復(fù)染，用已知陽性片作陽性對(duì)照，以PBS 代替Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。

2.3 結(jié)果判讀 ERK5 染色的評(píng)分由2 個(gè)獨(dú)立和有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生判讀。陽性表達(dá)為細(xì)胞漿染色，主要表現(xiàn)為胞漿內(nèi)非均勻棕黃色顆粒。結(jié)果判讀采用半定量積分分級(jí)，積分=染色強(qiáng)度×染色細(xì)胞比例。染色強(qiáng)度:0 分為陰性(無色)，1 分為淺灰色，2 分為淡黃色，3 分為黃色，4 分為棕黃色;染色細(xì)胞比例:0 分為無陽性細(xì)胞，1 分為1%～25%，2 分為26% ～50%，3 分為51% ～75%，4 分為76% ～100%［15］。兩者相乘為總的分?jǐn)?shù)，0 ～11 分納入低表達(dá)組，12 ～16 分被納入到高表達(dá)組。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行分析。采用χ2檢驗(yàn)分析ERK5 在正常黏膜組織和癌組織中的表達(dá)差異以及ERK5 表達(dá)水平和各項(xiàng)臨床參數(shù)的相關(guān)性。通過Kaplan-Meier 生存分析ERK5 的表達(dá)水平及各個(gè)臨床參數(shù)與預(yù)后的關(guān)系;然后通過Cox 回歸分析腫瘤預(yù)后相關(guān)的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。

結(jié) 果

1 ERK5 在正常黏膜和結(jié)直腸腺癌中的表達(dá)

ERK5 在正常黏膜和癌組織中表達(dá)均位于胞漿，未見明顯胞核染色，見圖1。根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，分為高表達(dá)(≥12 分)和低表達(dá)(＜12 分)兩組。80 例正常黏膜標(biāo)本中，59 例(73.8%)低表達(dá)，21 例(26.2%)高表達(dá);338 例結(jié)直腸癌標(biāo)本中，204 例(60.4%)為低表達(dá)，134 例(39.6%)高表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn):2 組ERK5 蛋白表達(dá)水平有顯著差異，ERK5 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常黏膜組織(P ＜0.05)，見表1、圖1D1、2。

Figure 1. Immunohistochemical analysis of the expression of ERK5 protein (upper panels，×100;lower panels，×400).ERK5 expression was localized within the cytoplasm. A1 and A2:only weak staining of ERK5 was detected in normal colorectal epithelial tissue;B1 and B2:moderately positive expression of ERK5 in CRC without distant metastasis;C1 and C2:strongly positive expression of ERK5 in CRC with distant metastasis;D1 and D2:elevated ERK5 expression in the tumor cells of CRC tissue compared with those of adjacent normal mucosa.圖1 免疫組織化學(xué)法檢測ERK5 在結(jié)直腸癌腺體及正常腺體中的表達(dá)

表1 ERK5 在正常結(jié)直腸粘膜和結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)Table 1. ERK5 expression in normal mucosa and CRC tissues

2 ERK5 表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析

通過χ2檢驗(yàn)分析ERK5 的表達(dá)和臨床參數(shù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，ERK5 高表達(dá)與結(jié)直腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P ＜0.05)呈正相關(guān)。然而，腫瘤組織中ERK5 表達(dá)量與性別、年齡、BMI、腫瘤位置、T 分期、N 分期、TNM 分期和分化程度無明顯相關(guān)(P ＞0.05)，見表2。

在轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌標(biāo)本中ERK5 的表達(dá)強(qiáng)度明顯增高，27 例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌標(biāo)本中，17 例(63.0%)標(biāo)本中高表達(dá)ERK5 蛋白(見圖1 C1、2);相反的，在311 例未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌標(biāo)本中，僅僅117 例(37. 6%)標(biāo)本高表達(dá)ERK5 蛋白。這表明:與未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者相比，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的癌組織中的ERK5 蛋白表達(dá)水平更高。

3 生存分析

病人的平均隨訪時(shí)間61.06 個(gè)月，中位隨訪時(shí)間62.00 個(gè)月。311 例原發(fā)性結(jié)直腸癌患者總的5年生存率為68.5%，98 例患者死亡。我們通過單因素的log -rank 檢驗(yàn)顯示，結(jié)腸癌和直腸癌腫瘤組織中高表達(dá)ERK5 的患者總體5 年生存率和低表達(dá)組無明顯差異(P ＞0.05)，見圖2A。但是，通過進(jìn)一步的分層分析，在直腸癌中腫瘤組織中高表達(dá)ERK5的患者總體5 年生存率明顯低于低表達(dá)組(P ＜0.05)，見圖2B。表3 顯示與結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)的臨床參數(shù)包括腫瘤位置(P ＜0.01)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.01)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P ＜0.01)以及TNM 分期(P ＜0.01)。

單因素生存分析有意義的指標(biāo)被納入多因素生存分析;但是，TNM 分期與T 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是一致的，所以我們將TNM 分期從最終的模型里剔除［16］。多因素Cox 生存分析結(jié)果顯示:臨床參數(shù)中遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P ＜0.05)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P＜0.01)和腫瘤位置(P ＜0.01)是結(jié)直腸癌患者總體5 年生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，見表3。

討 論

ERK5 蛋白被報(bào)道在多個(gè)腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中有重要作用，其通過調(diào)控黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)信號(hào)促進(jìn)整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附和增強(qiáng)癌細(xì)胞活力;同時(shí)，ERK5 的激活可以促進(jìn)Src 蛋白相關(guān)的浸潤黏附因子形成進(jìn)而限制Rho蛋白的活性［17］。在伴有遠(yuǎn)處骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌中，ERK5 蛋白的表達(dá)量明顯升高，并通過促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase -9，MMP -9)的生成促進(jìn)了前列腺癌的進(jìn)展［18］;2008 年，Sticht 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的磷酸化ERK5 和口腔鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展以及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān);在乳腺癌細(xì)胞中，ERK5 信號(hào)通路通過MET 受體/乳腺腫瘤激酶信號(hào)(BRK)介導(dǎo)HGF 誘導(dǎo)的癌細(xì)胞遷移，在乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程中起重要作用［19］;這些研究提示ERK5蛋白可能和腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。

表2 ERK5 的表達(dá)情況與結(jié)直腸癌患者臨床病理資料的關(guān)系Table 2. Correlation between ERK5 expression and clinicopathologic characteristics

我們通過免疫組化的方法檢測338 例癌組織和80 例癌旁正常的黏膜組織中的ERK5 表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)ERK5 在結(jié)直腸癌患者的癌組織中表達(dá)較癌旁正常組織中升高，這一結(jié)果和國內(nèi)另一家研究單位報(bào)道的結(jié)果一致［20］。進(jìn)一步分析ERK5 的表達(dá)情況和各個(gè)臨床參數(shù)的關(guān)系顯示:在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者癌組織中，檢測到ERK5 高表達(dá)的頻率較沒有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的腫瘤組織標(biāo)本中表達(dá)量高(P ＜0.05)。這表明ERK5 可能在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中扮演了非常重要的角色，這一現(xiàn)象和之前報(bào)道的在前列腺癌、乳腺癌中的研究結(jié)果一致［18-19］。

Figure 2. Survival analysis of primary colorectal cancer patients (n=311). A:no correlation was found between colorectal cancer patient survival and the expression of ERK5 (P ＞0.05);B:for rectal cancer patients，ERK5 -high group showed worse survival than that in ERK5 -low group (P ＜0.05)P values were calculated using the log-rank test.圖2 不同ERK5 表達(dá)水平的結(jié)直腸癌患者生存曲線的比較

表3 311 例結(jié)直腸癌患者總體5 年生存率的Kaplan－Meier 單因素及Cox 多因素分析Table 3. Kaplan-Meier univariate analysis and Cox proportional hazards model multivariate analysis of individual parameters for correlations with 5 -year overall survival

目前結(jié)直腸癌診療面臨的最大的挑戰(zhàn)之一是早期診斷結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的是否需行輔助治療的判斷［21］。對(duì)于早期的結(jié)直腸癌患者，僅僅需要外科手術(shù)治療［22］;而對(duì)于進(jìn)展期的患者，除了手術(shù)治療外還需要化療或者放療的輔助性治療提高患者生存期［23］。目前臨床上，癌胚抗原CEA 被作為一個(gè)診斷和隨訪監(jiān)測結(jié)直腸癌患者的重要指標(biāo)。但是，CEA 并非結(jié)直腸癌所特有的標(biāo)志物，它在良性肝臟疾病、炎癥性腸病、胰腺炎、其它惡性腫瘤以及吸煙患者血液中也會(huì)升高［24］。國外一篇文獻(xiàn)薈萃分析報(bào)道，CEA 監(jiān)測結(jié)直腸癌患者術(shù)后轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的敏感度為64%［25］。因此，我們需要找到一些特異性和敏感度好的標(biāo)記物用于結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移診斷及術(shù)后監(jiān)測。我們的研究發(fā)現(xiàn)ERK5 在轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌中表達(dá)是明顯升高，這個(gè)現(xiàn)象預(yù)示ERK5 的表達(dá)升高和結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。對(duì)于臨床未發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而腫瘤組織中ERK5 高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者我們需要更為密切的關(guān)注以及更多的輔助檢查是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

我們通過Kaplan-Meier 生存分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)ERK5 僅僅在直腸癌患者中與總體5 年生存率相關(guān)(P ＜0.05)。338 例結(jié)直腸癌患者臨床預(yù)后資料的Cox 多因素生存分析提示淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤的位置是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因子。

綜上所述，高表達(dá)的ERK5 和結(jié)直腸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，腫瘤組織中高表達(dá)ERK5 的結(jié)直腸癌患者可能需要更多的輔助性治療和更為緊密的隨訪。但是，本研究中發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移標(biāo)本例數(shù)偏少，可能會(huì)帶來統(tǒng)計(jì)學(xué)上的誤差，ERK5 能否作為臨床上治療選擇標(biāo)記物及其促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。

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