羅 婷，鐘先鋒，李 靜，劉小如，鄧澤元

南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌330047

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的前期階段，血管內(nèi)膜附有一層內(nèi)皮細(xì)胞，是非常光滑的，動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生常伴有內(nèi)皮細(xì)胞損傷或脫落［1］，血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙是AS發(fā)生的始動(dòng)因素［2］。故進(jìn)行早期預(yù)防內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙對(duì)AS的發(fā)病具有積極的作用［3］。

丹參酮ⅡA(Tanshinone IIA，TIIA)具有明顯的抗氧化應(yīng)激作用［4］，氧化應(yīng)激通過產(chǎn)生氧自由基介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，與血管內(nèi)皮功能障礙有著密切的關(guān)系。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)丹參酮ⅡA具有抗氧化的作用，并且能夠抑制羥自由基引起的脂質(zhì)過氧化［5］。本研究以培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為材料，觀察丹參酮ⅡA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，探討丹參酮ⅡA保護(hù)損傷后的血管內(nèi)皮細(xì)胞和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(Human vascular endothelial cells，HUVECs)由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供;DMEM (Invitrogen corporation);胰蛋白酶(Sigma公司); MTT(Sigma公司);胎牛血清(Gibco公司);丹參酮ⅡA(中國(guó)生物制品檢定所;批號(hào):110766-200518;純度:98%以上);DMSO(天津大茂公司);乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、一氧化氮合酶(nitrogen oxide synthase，NOS)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)，丙二醛(malondialdehyd，MDA)、一氧化氮(nitric oxide，NO)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱(SanYo);生物安全柜(蘇凈集團(tuán)安泰公司);倒置顯微鏡(上海光學(xué)儀器進(jìn)出口有限公司);MK3型酶標(biāo)儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司);臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)(Heal Force)等。

1.3 方法

1.3.1 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng):取人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞接種于50 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，待細(xì)胞鋪滿80%～90%的瓶底表面積后，用0.25%的胰蛋白酶消化1 min，離心，分裝于新的培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第二天換培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第3天進(jìn)行傳代。如上述方法正常培養(yǎng)3代以上后，將內(nèi)皮細(xì)胞分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT法測(cè)定丹參酮ⅡA對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響

離心收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，以2×104～5×104個(gè)/ mL的密度接種于96孔板中，5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗去未貼壁細(xì)胞。換用無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8 h，使細(xì)胞同步化。然后換用含5%胎牛血清和不同濃度丹參酮ⅡA的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，其中丹參酮ⅡA分6個(gè)濃度，分別是400、200、100、40、20、10 μmol/L，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔和對(duì)照孔。24 h后終止培養(yǎng)，每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL，在37℃體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵育4 h。棄去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，并用酶標(biāo)儀OD490nm處測(cè)定各孔的吸光值。

1.3.3 MTT法測(cè)定丹參酮ⅡA對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

將細(xì)胞分為對(duì)照組(在細(xì)胞培養(yǎng)體系中不施加任何干預(yù)因素)、H2O2組(在細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入100 μmol/L的 H2O2)和藥物干預(yù)組(10～100 μmol/L丹參酮ⅡA+100 μmol/L H2O2)［7］。前期實(shí)驗(yàn)操作同1.3.2，加入丹參酮ⅡA后，培養(yǎng)24 h，加入100 μmol/L H2O2作用內(nèi)皮細(xì)胞6 h，換入無血清DMEM培養(yǎng)液100 μL/孔，并于每孔加入MTT(5 mg/mL)10 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入DMSO使結(jié)晶物溶解，并用酶標(biāo)儀OD490nm處測(cè)定各孔的吸光值。

1.3.4 測(cè)定丹參酮ⅡA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞LDH、SOD、MDA、NOS、NO和GSH的影響

使用試劑盒，按照試劑盒說明書測(cè)定每組內(nèi)皮細(xì)胞中LDH釋放率，MDA、NOS、NO、SOD和GSHPx的變化。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

實(shí)驗(yàn)分組同1.3.2，內(nèi)皮細(xì)胞用胰酶消化后，PBS洗滌2遍，離心(1000 rpm，5 min)獲取細(xì)胞，加入100 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，使用5 μL FITC和5 μL PI在室溫避光反應(yīng)10～15 min，離心加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測(cè)。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，單因素方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并用LSD-t進(jìn)行了組間差異性比較;所得數(shù)據(jù)用±s表示，P＜0.05表示差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

如圖1所示，低劑量添加丹參酮ⅡA對(duì)正常內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有影響，但在濃度達(dá)到200 μmol/L時(shí)，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，可能過量的丹參酮ⅡA會(huì)對(duì)內(nèi)皮產(chǎn)生細(xì)胞毒性。圖1顯示，丹參酮ⅡA添加濃度于10～100 μmol/L之間時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞的存活率沒有明顯影響，但當(dāng)上升到400 μmol/L，內(nèi)皮細(xì)胞的存活率也于100%下降到57.4%，隨著丹參酮ⅡA添加濃度的升高，丹參酮ⅡA對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用越來越明顯，呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。

圖1 丹參酮ⅡA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響Fig.1 The effect of Tanshinone IIA on the proliferation of HUVECs

2.2 丹參酮ⅡA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

根據(jù)2.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇了較低濃度(5～100 μmol/L)的丹參酮ⅡA來保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，以排除細(xì)胞毒性的影響。從圖2可以看到，丹參酮ⅡA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用顯濃度依賴關(guān)系。比較藥物添加各組和H2O2組，添加5、10 μmol/L的丹參酮ⅡA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用不明顯(P＜0.05)，而添加量上升到20 μmol/L，則有顯著的保護(hù)作用。

圖2 丹參酮ⅡA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用Fig.2 Protective effects of Tanshinone IIA on HUVECs from oxidative injury

2.3 丹參酮ⅡA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞 LDH、SOD、MDA、NOS、NO和GSH的影響

從表1可以看到，H2O2組的LDH釋放率和MDA與對(duì)照組相比顯著上升，LDH釋放率從36.28%上升到54.89%，MDA從23.78 nmol/mg prot上升到45.70 nmol/mg prot。加入丹參酮ⅡA處理后，LDH釋放率和MDA有不同程度下降，如100 μmol/L丹參酮ⅡA預(yù)處理組與H2O2組比較，LDH釋放率下降為44.75%，MDA下降為33.57 nmol/mg prot，說明內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)丹參酮ⅡA預(yù)處理，可以抵御氧自由基損傷，降低細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物，維護(hù)生物膜的完整性。

NOS是維持內(nèi)皮細(xì)胞生理功能的重要活性物質(zhì)，能清除體內(nèi)自由基。NO可促進(jìn)血管舒張，并抑制增生作用［6］。H2O2組與對(duì)照組相比，內(nèi)皮細(xì)胞NOS表達(dá)減少，其產(chǎn)物NO水平也隨之降低，隨著丹參酮ⅡA加入，NO水平回升。

細(xì)胞內(nèi)同時(shí)存在清除過量氧自由基的系統(tǒng)，如SOD和GSH-Px，這些抗氧化酶可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和正常生理功能的作用。本研究表明:與對(duì)照組相比，H2O2組SOD和GSH-Px活性顯著降低。與H2O2組相比，50和100μmol/L丹參酮ⅡA均可增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的SOD、GSH-Px活性，SOD活力分別為112.51 U/mgprot和131.37 U/mgprot (P＜0.05);GSH-Px活力分別為176.52 U/mgprot和212.96 U/mgprot(P＜0.05)。且隨濃度的增加，細(xì)胞的SOD和GSH-Px活性也逐漸提高，表明丹參酮ⅡA可增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的抗氧自由作用，具一定的量效關(guān)系。

表1 丹參酮ⅡA對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞LDH、MDA、NOS、NO、SOD和GSH-PX的影響Table 1 Effects of Tanshinone IIA on LDH，MDA，NOS，NO，SOD，GSH-PX in HUVECs

2.4 丹參酮ⅡA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

從圖3可以看到，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)H2O2氧化損傷后，41.7%的細(xì)胞進(jìn)入早期凋亡，2.1%的細(xì)胞進(jìn)入晚期凋亡或者壞死，而丹參酮ⅡA預(yù)處理組(50 μmol/L)，有23.2%的細(xì)胞進(jìn)入早期凋亡，0.6%的細(xì)胞進(jìn)入晚期凋亡或者壞死，提示丹參酮ⅡA可以保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化損傷，降低細(xì)胞凋亡率，維持正常生理功能防止AS的形成。

圖3 FITC-PI通道的二維散點(diǎn)圖Fig.3 Bivariate graphs illustrate the FITC-PI fluorescent resolution of HUVECs

3 討論

人體內(nèi)多種因素導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，如炎癥因子、失去平衡的調(diào)節(jié)因子、活性氧、脂肪氧化酶等，其中活性氧產(chǎn)生的氧化損傷是其中重要的因素之一［7］。人體正常生理活動(dòng)過程伴有氧化性物質(zhì)參與，主要為氧自由基。氧自由基可以參與人體的物質(zhì)代謝和信號(hào)傳導(dǎo)，對(duì)細(xì)胞發(fā)揮正常生理功能起著重要作用。但是人體產(chǎn)生過量氧自由基或者清除能力下降時(shí)，則對(duì)人體內(nèi)各種細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的氧化損傷。

實(shí)驗(yàn)室為了建立氧化損傷模型，多采用H2O2、乙醇和ox-LDL等試劑，本研究利用H2O2產(chǎn)生O來建立HUVECs損傷模型，因?yàn)樵撓到y(tǒng)經(jīng)濟(jì)科學(xué)，方便易行，適于快速誘導(dǎo)損傷建立模型，進(jìn)而大量篩選藥物。綜合文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，本文采用200 μmol/L的H2O2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

從自然界中提取的部分植物化合物對(duì)細(xì)胞有細(xì)胞毒性，在研究各種化合物對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用時(shí)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的藥物濃度應(yīng)在不產(chǎn)生細(xì)胞毒性的范圍內(nèi)。在本研究中，當(dāng)?shù)⑼駻添加濃度上升到200μmol/L，對(duì)HUVECs的增殖產(chǎn)生抑制作用，有顯著性差異(圖1)。所以本研究的實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的藥物濃度為5～100 μmol/L。

氧自由基損傷細(xì)胞膜上的脂質(zhì)，使其過氧化分解生成脂質(zhì)過氧化物，如MDA。MDA能與蛋白質(zhì)、氨基酸及其它細(xì)胞成分作用，最終使磷脂結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，生物膜受到嚴(yán)重的損害，致使細(xì)胞活力下降，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的LDH外漏［8］。丹參酮ⅡA也促進(jìn)了NOS和NO的生成量(表1)，為了應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激，恢復(fù)平衡狀態(tài)，相對(duì)正常分泌水平過量產(chǎn)生的NOS和NO能清除體內(nèi)自由基，維持血管正常生理功能。隨著丹參酮ⅡA加入，NO水平回升。丹參酮ⅡA也促進(jìn)了SOD和GSH-PX的分泌，SOD和GSH-PX是體內(nèi)清除過量氧自由基的系統(tǒng)，能消除人體在吸收代謝過程中生成的有毒有害物質(zhì)，如超氧陰離子自由基，體內(nèi)依靠SOD和GSH-PX系統(tǒng)可以維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)的平衡。

研究證實(shí)在動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊中存在著血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象。而且血管內(nèi)皮細(xì)胞位于血管最內(nèi)層，直接與循環(huán)血液接觸，因此較易受到血液中活性物質(zhì)及血液剪切力的影響，在心腦血管疾病的發(fā)生過程中處于關(guān)鍵環(huán)節(jié)［9］。細(xì)胞凋亡導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)的DNA因漏出而減少，加入丹參酮ⅡA預(yù)處理后，大大減少了凋亡率，保持了內(nèi)皮細(xì)胞的正?；盍蜕砉δ堋?/p>

綜合上述，丹參酮ⅡA在10～100 μmol/L濃度下，無細(xì)胞毒性;加入丹參酮ⅡA預(yù)處理后，減弱了因H2O2引起的細(xì)胞的過度脂質(zhì)過氧化，維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，減少了LDH釋放率和MDA生成量，增加了NOS、NO、SOD和GSH等抗氧化物質(zhì)的分泌量，阻礙了細(xì)胞凋亡和在血管表皮上形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，阻止AS的發(fā)生和發(fā)展。

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