王 穎，張桂芳，徐炳政，姚 笛，張東杰*

1黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院;2黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，大慶，163319

糖尿病是由遺傳因素、免疫功能失調(diào)、自由基毒素等多種致病因子作用于機(jī)體導(dǎo)致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發(fā)的糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合癥。近年來，糖尿病發(fā)病率急速上升，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，糖尿病已成為繼惡性腫瘤和心腦血管疾病之后的第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性非傳染性疾?。?］。目前對于糖尿病的根治尚無有效方法，臨床上常用于糖尿病治療的西藥雖然對血糖有較好的控制作用，但毒副作用較大。因此，尋找安全、廉價(jià)、有效降糖的天然產(chǎn)物及成分對于糖尿病治療具有重要意義。葡萄籽原花青素提取物是從葡萄籽中分離出的多酚類混合物，現(xiàn)代研究表明，GSPE具有極強(qiáng)的抗氧化活性［2，3］，并且具有調(diào)節(jié)血脂［4］和預(yù)防心血管疾?。?，6］等作用。目前，抗氧化活性成為GSPE研究的熱點(diǎn)，但其降糖作用及作用機(jī)制卻鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)旨在研究GSPE的降血糖作用及其作用機(jī)制，為新型降糖藥物和功能性食品的深入開發(fā)提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物材料

昆明種小鼠，雄性，體重(20～25)g，購自長春生物制品廠，小鼠飼料為標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

葡萄籽原花青素提取物(GSPE，純度＞95%，購自天津尖蜂天然產(chǎn)物有限公司，實(shí)驗(yàn)前用蒸餾水溶解，配制成所需濃度);格列本脲(國藥準(zhǔn)字H11020883，北京太洋藥業(yè)有限公司);四氧嘧啶(ALX，上海億欣生物科技有限公司);怡成血糖測試儀及測定試紙(北京怡成生物電子技術(shù)有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒與丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所);碘［125I］胰島素放射免疫分析藥盒(上海瑞齊生物科技有限公司);KDC-40低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司);氯化鈉(國產(chǎn)分析純)等。

1.3 糖尿病模型的建立方法

健康小鼠50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，稱重。隨機(jī)選取10只作為正常對照組，其余分為四個(gè)模型組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)，每組10只。模型組小鼠禁食不禁水12 h后，腹腔注射ALX生理鹽水溶液(濃度2%，新鮮配制)，其余四組分別按80、70、60和50 mg/kg四個(gè)劑量連續(xù)腹腔注射4 d。模型建立期間，采用小鼠尾部靜脈取血法，每天測定給藥8 h后的小鼠空腹血糖值，觀察小鼠血糖變化。按文獻(xiàn)方法［7，8］，選用血糖值≥14.5 mmol/L的小鼠作為糖尿病成功模型。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與飼養(yǎng)

取健康小鼠70只，隨機(jī)抽取10只為正常對照組(BD)，其余按ALX誘導(dǎo)糖尿病最佳作用濃度腹腔注射，建立糖尿病模型。將成功造模糖尿病小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別標(biāo)記為模型對照組(MoD)、格列本脲處理組(GD)、GSPE低劑量組(LD)、GSPE中劑量組(MD)和 GSPE高劑量組(HD)。

每組小鼠(10只)飼養(yǎng)在塑料飼養(yǎng)籠中，飼養(yǎng)籠底部墊有碎紙屑，頂部為鋼絲網(wǎng)蓋，配有自動(dòng)飲水器，室溫(20±1)℃，相對濕度50%±5%，喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。

1.5 給藥劑量和方法

每天同一時(shí)間灌胃給藥1次，連續(xù)給藥21 d。具體藥物劑量見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的藥劑分配Table 1 Reagent distribution of experimental animals

1.6 血糖值及體重測定方法

實(shí)驗(yàn)期間每天觀察小鼠體態(tài)特征變化，記錄死亡率;分別于給藥0、7、14和21 d的同一時(shí)間，測定空腹血糖值及體重。

1.7 口服糖耐量試驗(yàn)

糖尿病模型小鼠各組于末次給藥后禁食8 h，口服葡萄糖2.5 g/kg，分別于0、0.5、1.0、2.0 h進(jìn)行尾部靜脈取血，測定血糖值。

1.8 血清指標(biāo)檢測

小鼠灌胃實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，摘取眼球，取血，離心，取血清，按照試劑盒方法測定血清中胰島素含量、MDA含量和SOD活性［9］。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 糖尿病小鼠模型的建立

如圖1、圖2所示，與正常對照組比較，腹腔注射四氧嘧啶能明顯提高小鼠血糖值，且具有穩(wěn)定性。在注射的第1、2 d高劑量注射組的死亡率低于低劑量注射的死亡率，而第3、4 d，高劑量注射組的死亡率明顯上升。由此可知，四氧嘧啶注射第2 d適合藥物篩選，選擇第1 d 80 mg/kg ALX溶液，第二天追加80 mg/kg ALX溶液，糖尿病小鼠模型成功率最高，死亡率＜10%。

圖1 不同濃度ALX處理后小鼠血糖濃度變化Fig.1 Blood glucose change of mice treated by ALX in different concentrations

圖2 不同濃度ALX處理小鼠后的死亡率Fig.2 Mortality rate of mice treated by ALX in different concentrations

2.2 一般情況

小鼠造模成功后，明顯出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀，小鼠活動(dòng)率降低，精神萎靡，皮毛粗糙。灌喂給藥后，格列本脲處理組、GSPE試驗(yàn)組小鼠糖尿病癥狀緩解，精神狀態(tài)良好。

2.3 GSPE對ALX糖尿病小鼠體重的影響

圖3為GSPE對ALX糖尿病小鼠體重的影響。小鼠造模成功后，分別記錄0、7、14、21 d體重。給藥0～7 d，糖尿病小鼠體重下降明顯。連續(xù)21 d給藥，GSPE各劑量組小鼠體重均有所上升，GSPE高劑量組對糖尿病小鼠體重影響與格列苯脲作用效果相似，體重增加明顯(P＜0.05)。表明GSPE能夠有效緩解糖尿病小鼠消瘦癥狀，對糖尿病小鼠體重下降具有一定的治療與恢復(fù)作用。

圖3 GSPE對ALX糖尿病小鼠體重的影響Fig.3 Effect of GSPE on the body weights of ALX diabetic mice

2.4 GSPE對ALX糖尿病小鼠空腹血糖的影響

圖4為GSPE對ALX糖尿病小鼠空腹血糖的影響。由圖可以看出，與正常對照組比較，腹腔注射ALX后，所有糖尿病小鼠空腹血糖值均明顯升高，且具有顯著性，表明糖尿病小鼠模型造模成功。小鼠灌胃給藥21 d后，模型對照組血糖仍處于較高水平。與模型對照組比較，格列本脲處理組小鼠血糖顯著降低(P＜0.01)，GSPE中、高劑量組血糖顯著降低(分別為P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)果提示，GSPE可以降低ALX誘導(dǎo)糖尿病小鼠血糖，降糖效果與藥物劑量成正相關(guān)。

圖4 GSPE對ALX糖尿病小鼠空腹血糖的影響Fig.4 Effect of GSPE on fasting blood glucose of ALX diabetic mice

2.5 GSPE對ALX糖尿病小鼠葡萄糖耐受量的影響

圖5為GSPE對ALX糖尿病小鼠葡萄糖耐受量的影響。由圖可以看出，給予葡萄糖0.5 h后，各組小鼠血糖值升至最大值后逐漸下降。與模型對照組比較，0.5 h時(shí)，GSPE低、中、高劑量組均可抑制四氧嘧啶高糖小鼠葡萄糖負(fù)荷后血糖的升高;與模型對照組比較，2 h后，GSPE中、高劑量組血糖下降顯著(分別為P＜0.05，P＜0.01)。表明GSPE有提高糖尿病小鼠對葡萄糖的耐受能力作用，且高劑量作用效果較好。

圖5 GSPE對ALX糖尿病小鼠葡萄糖耐受量的影響Fig.5 Effect of GEPE on glucose tolerance of ALX diabetic mice

2.6 GSPE對ALX糖尿病小鼠胰島素水平的影響

圖6為GSPE對ALX糖尿病小鼠胰島素水平的影響。與正常對照組比較，模型對照組小鼠胰島素含量下降顯著(P＜0.01);與模型對照組比，GSPE低、中劑量組胰島素水平上升明顯(P＜0.05);格列本脲處理組和GSPE高劑量組胰島素水平上升顯著(P＜0.01)。結(jié)果提示，GSPE降低糖尿病小鼠的血糖值與其能夠提高胰島素水平有關(guān)。

2.7 GSPE對ALX糖尿病小鼠血清MDA含量和SOD活性的影響

圖8 GSPE對ALX糖尿病小鼠血清SOD活性的影響Fig.8 Effect of GSPE on serum SOD activity of ALX diabetic mice

圖7和圖8分別為GSPE對ALX糖尿病小鼠血清MDA含量和血清SOD活性的影響。血清MDA含量與SOD活性是評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)。由圖可以看出，與正常對照組比較，模型對照組小鼠血清MDA含量顯著升高(P＜0.01)，SOD活性顯著降低(P＜0.01)，表明模型組小鼠機(jī)體抗氧化能力明顯低于正常對照組小鼠，提示四氧嘧啶注射對小鼠抗氧化能力具有減弱作用。但經(jīng)灌胃給藥GSPE以及腹腔注射格列苯脲后，ALX糖尿病小鼠血清MDA含量和SOD活性有不同程度的改善。與模型對照組小鼠比較，GSPE中、高劑量組糖尿病小鼠的血清MDA含量明顯下降(P＜0.05)，血清SOD活性明顯提高(中劑量組P＜0.05，高劑量組P＜0.01);結(jié)果提示，GSPE具有恢復(fù)糖尿病小鼠抗氧化能力的效果，中、高劑量組作用效果較好。

3 討論

四氧嘧啶是一種特異性的β-細(xì)胞毒劑，其在體內(nèi)可被胰島β-細(xì)胞有效吸收，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過量自由基，改變?chǔ)?細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致胰島β-細(xì)胞的損傷和壞死，胰島素水平降低而出現(xiàn)高血糖等糖尿病癥狀［10，11］，同時(shí)糖尿病引起的高血糖可使體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，引起氧化應(yīng)激升高，破壞機(jī)體的抗氧化能力，引起β-細(xì)胞損傷持續(xù)惡化［12］，這種作用機(jī)制與臨床上Ⅱ型糖尿病相似［13］。四氧嘧啶能夠有效引起血糖升高，且讓其長時(shí)間處于較高水平。因此，本實(shí)驗(yàn)采用ALX為誘導(dǎo)劑構(gòu)建糖尿病模型，在此模型上研究GSPE對糖尿病小鼠的影響。

本實(shí)驗(yàn)在ALX誘導(dǎo)小鼠糖尿病摸索過程中，與正常小鼠比較，四個(gè)模型組血糖均顯著上升，小鼠精神萎靡，體重下降，出現(xiàn)“三多”典型糖尿病特征，說明四氧嘧啶誘導(dǎo)糖尿病小鼠成功，但是誘導(dǎo)后期，小鼠出現(xiàn)大量死亡，可能是由于四氧嘧啶導(dǎo)致小鼠β-細(xì)胞嚴(yán)重受損，體內(nèi)糖代謝與脂質(zhì)代謝嚴(yán)重紊亂［4］。檢查死亡小鼠，部分出現(xiàn)腹部腫脹，可能是由于胰島及臟器受損充水腫脹破裂。由此，本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)小鼠模型采用追加藥物法，第一天注射四氧嘧啶溶液為80 mg/kg，第二天注射四氧嘧啶溶液為80 mg/kg，采用本方法，小鼠造模成功率高，死亡率較低。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ALX引起小鼠體重下降，空腹血糖值上升，血清MDA含量升高，SOD活性降低，血清胰島素水平下降等，與文獻(xiàn)報(bào)道相似［14，15］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GSPE能夠降低糖尿病小鼠的空腹血糖、提高糖耐量，增加體重，提升機(jī)體胰島素水平，試驗(yàn)期間小鼠皮毛出現(xiàn)光澤，飲食、飲水量趨于正常，活動(dòng)量增加，提示GSPE降糖作用機(jī)制可能與修復(fù)受損胰島β-細(xì)胞，提升胰島素水平有關(guān)。SOD是機(jī)體清除氧自由基的重要酶類，高血糖可使SOD活性下降，減弱其對自由基的清除。機(jī)體大量自由基是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥的主要因素。GSPE可以改善糖尿病小鼠SOD活性，降低MDA含量，表明GSPE可以通過提高機(jī)體抗氧化能力，清除體內(nèi)自由基來預(yù)防和治療糖尿病及其并發(fā)癥。

1 Cockram C.Type 2 Diabetes Practical Targets and Treatments.Asian-pacific type 2 diabetes policy group，2005.1-6.

2 Wu YJ(吳英俊)，Liang YF(梁憶非)，Dong JN(董嘉楠).Advances in research of grape seed proanthocyanidin.J Trop Med(熱帶醫(yī)學(xué)雜志)，2010，10:1025-1028.

3 Zhu ZQ(朱振勤)，Zhai WY(翟萬銀)，Chen JW(陳季武)，et al.Studies on the antioxidation effects of grape seed procyanidins extract.J East China Normal Univ(Nat Sci) (華東師范大學(xué)學(xué)報(bào)，自科版)，2005，(1):98-102.

4 Yan SF(閆少芳)，Li Y(李勇)，Wu J(吳娟)，et al.Study of the effect of grape seed extract procyanidin on blood lipid regulation and mechanism.Chin J Food Hyg(中國食品衛(wèi)生雜志)，2003，15:302-304.

5 Xue YW(薛燕濰)，Wang F(王峰).Anti-atherosclerosis of procyanidin on experimental rat and its mechanisms.Chin Prac Med(中國實(shí)用醫(yī)藥)，2010，13:44-45.

6 Bi L(畢玲)，F(xiàn)u BP(傅柏平).Advances in research of grape seed proanthocyanidin extracts.Chin New Drugs J(中國新藥雜志)，2008，17:1478-1481.

7 Chen HY(陳紅艷)，Yang XB(楊新波).Diabetic model induced by alloxan in mice and its affecting factors.Bull Acad Mil Med Sci(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊)，2005，29:535-542.

8 Xiao XH(肖小華)，Xu LY(徐麗瑛)，Zhu LY(朱令元)，et al.Study on the model of diabetic mice and rat induced by alloxan.Sci Mosaic(科技廣場)，2010，10:112-114.

9 Li JZ(李記爭)，Yang G(楊光).Studies of the hypoglycemic effect of Sonchus oleraceus extract on experimental diabetic mice.Lishizhen Med Mater Med Res(時(shí)珍國醫(yī)國藥)，2011，22:419-421.

10 Wang LP(王柳萍)，Yang B(楊斌)，Zhou L(周麗).Studies on the factors affecting the diabetic model induced by alloxan in mice.J Guangxi Med Univ(廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào))，2004，21:33-35.

11 Sharma B，Viswanath G，Salunke R，et al.Effects of flavonoid-rich extract from seeds of Eugenia jambolana(L)on carbohydrate and lipid metabolism in diabetic mice.Food Chem，2008，110:697-705.

12 Wang XL(王曉凌)，Jiang LL(姜玲玲)，Ma J(馬靜)，et al.Changes of very long-chain free fatty acids in serum and liver tissues of rats with diabetes induced by high fat food.Chin Gen Pract(中國全科醫(yī)學(xué))，2008，11:306-308.

13 Liu D(劉丹)，Lan QQ(藍(lán)青強(qiáng))，Ren M(任明)，et al.Insulin resistance syndrome and treatment research of type 2 diabetes mellitus for machine.The 1st Academic Congress Specialty Committee of Geriatric Medicine，The World Federation of Chinese Medicine Societies(世界中醫(yī)藥學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)老年醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)成立大會(huì)暨第一屆學(xué)術(shù)會(huì)議)，2008.407-410.

14 Shi LX(施利仙)，ShangGuan XC(上官新晨)，Wang WJ (王文君)，et al.Effects of polysaccharide of Cyclocarya paliurus on alloxan-induced diabetic mice.Acta Nutr Sin(營養(yǎng)學(xué)報(bào))，2009，3:263-266.

15 Yin SL(殷松樓)，Zhou DM(周冬梅)，Liu CM(劉春梅)，et al.The effects of pioglitazone on oxidative stress of the hearts of diabetic rats.Shandong Med J(山東醫(yī)藥)，2010，37:21-22.