何傳新 袁安朋 張黔玲 任祥忠 李翠華 劉劍洪

(深圳大學化學與化工學院,深圳市功能高分子重點實驗室,廣東深圳518060)

1 引言

生物傳感器作為一種新型的分析手段,具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低,能在復雜體系中進行在線連續(xù)監(jiān)測等優(yōu)點,在臨床診斷、食品工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測等方面都有著重要的應用,并已成為現(xiàn)代分析化學和生命科學的一個重要分支.1-4在生物傳感器中,電化學生物傳感器是十分重要的一類,它是由生物識別分子(如酶、抗體、抗原和核酸等)作為敏感基元,電極作為轉換元件,以電流、電勢或電導等作為特征檢測信號的傳感器,其制備的一個關鍵步驟是生物活性分子的固定化.5-7如何利用載體有效地固定生物識別分子并保留其活性,對制備性能優(yōu)異的電化學生物傳感器至關重要.因此,性能優(yōu)良載體材料的合成,是高靈敏度、高選擇性生物傳感器成功研制的核心問題,已成為傳感技術研究領域的熱點和難點.8-10

酶是具有催化活性的一類蛋白質,能在常溫常壓的溫和條件下高效地催化反應,并且具有很強的選擇性.由于具備催化效率高和選擇性好的特點,酶常被作為生物識別分子,廣泛用于生物傳感器的制備.在生物傳感器的研究應用中,基于葡萄糖氧化酶的生物傳感器占到了80%以上.1主要是因為糖尿病患者日益增多,導致對葡萄糖傳感器的需求量大大增加,迫切需要開發(fā)出檢測精度高、響應速度快、性能穩(wěn)定和使用壽命長的葡萄糖傳感器;另外,在食品加工和發(fā)酵等領域,葡萄糖傳感器也有著重要的應用.葡萄糖氧化酶是廣泛存在于黑曲菌和青霉菌中的一種需氧脫氫酶,對β-D葡萄糖具有高度專一的催化氧化作用.11葡萄糖氧化酶是分子量為150至180 kDa的二聚體,結構包括580個氨基酸殘基,2個黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)輔因子,6個N-乙酰氨基葡萄糖殘基,3個甘露糖殘基.12-15在葡萄糖氧化酶進行催化作用的過程中,輔酶FAD起到電子和質子中間體的重要作用,即輔酶FAD通過它的氧化態(tài)和還原態(tài)的不斷循環(huán)而實現(xiàn)其功能.

由于納米粒子具有大的比表面積、表面反應活性高、催化效率高、吸附能力強等特點,基于納米粒子固定葡萄糖氧化酶構建傳感表面,是葡萄糖酶傳感器的一個重要發(fā)展方向.16-19納米粒子作為固定葡萄糖氧化酶的載體一方面可以提高酶的負載量,另一方面許多納米粒子尤其是金屬納米粒子具有良好的催化性能,能加快酶與電極表面之間的電子轉移,在葡萄糖酶傳感器中引入具有催化性能的納米粒子,可以提高傳感器的靈敏度、選擇性和響應速度.20-22雖然納米粒子在生物傳感器中得到廣泛應用,但也存在一些問題,例如許多納米粒子與生物識別分子相容性差,不能與生物識別分子直接作用,限制了其在生物傳感器中的應用.另外,用于人體實時監(jiān)測的生物傳感器,要求載體具有無毒且生物相容性好的特點.因此,設計合成具有良好生物相容性并能有效地負載生物活性分子的納米粒子,對生物傳感器的發(fā)展及在臨床醫(yī)學的應用起著十分關鍵的作用.BSA具有良好的生物相容性和血液相容性,它是由582個氨基酸殘基組成的單肽鏈蛋白質,分子量約為68000,其氨基酸序列與人血清白蛋白的氨基酸序列非常相似.23本文中我們利用銅離子引發(fā)體系,制備出核層為PMMA,殼層為BSA的PMMA-BSA核殼納米粒子.通過QCM-D實驗研究了PMMA-BSA納米粒子在金片表面的吸附.利用這種殼層為蛋白的納米粒子作為載體固定葡萄糖氧化酶,從而改善載體與葡萄糖氧化酶的相容性,制備出性能優(yōu)良的電流型葡萄糖傳感器.

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

試劑:葡萄糖氧化酶(GOx,來源于Aspergillus niger,25°C Specific acitivity＞100 units·mg-1)和牛血清白蛋白(BSA,純度＞98%)購于美國Amresco公司,直接使用;戊二醛水溶液(GA,50%)購于上海生工生物工程技術有限公司,稀釋后直接使用.甲基丙烯酸甲酯從國藥集團化學試劑有限公司購買,使用前通過堿洗除掉阻聚劑,干燥后減壓蒸餾;二茂鐵羧酸(FMCA)、氯化銅、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷鎢酸均為國藥集團化學試劑有限公司分析純試劑,使用前未經進一步處理.

儀器:日本電子JEM-1230透射電鏡電子顯微鏡(TEM);德國ALV/DLS/SLS-5022F激光光散射(LLS);英國VG科學儀器公司ESCALAB MK-11型X射線電子能譜儀(XPS);瑞典Q-senseAB帶耗散的石英晶體微天平(QCM-D);美國Nanoscope IIIa型原子力顯微鏡(AFM);上海辰華儀器公司生產的CHI660A型電化學工作站.

2.2 PMMA-BSA核殼納米粒子的制備與表征

取0.9156 g BSA加到反應器中,再加入29 mL去離子水,室溫攪拌30 min,使BSA充分溶解.移取1.5×10-4mol·L-1氯化銅水溶液1 mL,在攪拌下滴加到BSA水溶液中.通氮氣攪拌30 min后,加入5 mL甲基丙烯酸甲酯單體,攪拌15 min后,通循環(huán)水加熱.反應3 h獲得PMMA-BSA乳液.先采用離心再分散的方法粗略除掉乳液樣品中未反應的BSA和MMA,再用去離子水透析一周進一步除掉樣品中殘留的BSA和MMA.采用日本電子JEM-1230型透射電子顯微鏡來觀測PMMA-BSA粒子的結構,電子束的加速電壓是80 kV.取PMMA-BSA溶液滴加到鍍碳膜的銅網上,10 min后滴加1%(w)磷鎢酸,室溫染色2 min后,用濾紙從銅網邊緣吸走剩下的溶液,樣品經室溫真空干燥后測試.

2.3 基于PMMA-BSA納米粒子的電流型葡萄糖酶傳感器的制備

將金電極依次用1.0、0.3和0.05 μm的Al2O3打磨拋光,用去離子水清洗干凈后,分別在丙酮和去離子水中超聲5 min,反復三次,然后在0.5 mol·L-1H2SO4中于-0.2-1.5 V電位范圍內進行循環(huán)伏安掃描,直到得到穩(wěn)定循環(huán)伏安曲線,再用去離子水超聲清洗5 min,高純氮氣吹干后使用.

將處理過的金電極浸入到PMMA-BSA分散液(0.05 mol·L-1,pH 4.5的磷酸鹽緩沖液)中60 min;再浸入到磷酸鹽緩沖液浸洗;然后將電極浸入含GA的水溶液20 min,用去離子水洗凈后,再浸入0.5 mg·mL-1的GOx溶液(0.05 mol·L-1,pH 4.5磷酸鹽緩沖液)中60 min,最后再用磷酸鹽緩沖液浸洗,制備的電極用Au/PMMA-BSA-GA/GOx表示.

3 結果與討論

3.1 表征結果

圖1是PMMA-BSA粒子的TEM照片.從圖中可以觀察到,PMMA-BSA粒子具有明顯的核殼結構,核層和殼層具有清晰的分界,并且粒子分散良好,尺寸較為均一.通過TEM軟件分析,粒子半徑在55 nm左右,其中核層半徑約為20 nm,殼層厚度約為35 nm.從PMMA和BSA在水溶液中的溶解性質來分析,粒子應該形成了以PMMA為核,BSA為殼的結構.因為PMMA在水中不能溶解,而蛋白具有良好的水溶性.聚合時隨著PMMA鏈的增長, PMMA鏈通過疏水作用聚集形成粒子的核層,BSA分布在粒子的殼層,使得粒子在水溶液中穩(wěn)定分散.通過動態(tài)光散射(DLS)測得PMMA-BSA納米粒子的流體力學半徑為76 nm,粒子的分布較窄.DLS測得粒子半徑為比TEM測得半徑值大,這是因為TEM是在粒子干燥失去水分,殼層塌縮時測得的半徑,而DLS是在粒子充分溶脹時測得的結果.

由于氮元素是BSA的基本組成元素之一,而PMMA中不含有氮元素,所以可通過XPS分析PMMA-BSA粒子表面組成,為BSA是否位于PMMABSA粒子的殼層提供直接證據.圖2是PMMA-BSA在結合能為0-1200 eV范圍內的XPS全掃描圖譜.從圖中可以看出,PMMA-BSA的三個峰位分別出現(xiàn)在286、399和531 eV附近,對應于C、N、O的1s結合能.對于蛋白質和聚合物,XPS的測試深度為5-10 nm,所以PMMA-BSA中的N 1s峰說明BSA位于粒子的殼層.為了進一步證明BSA位于PMMABSA納米粒子的殼層,對上述氮元素進行了高分辨率XPS分譜掃描.圖3是BSA和PMMA-BSA的高分辨N 1s譜,可以看出二者N 1s譜基本吻合,結合能399.45 eV處的峰,是由BSA中的肽鍵(－CONH－)的氮產生,這充分說明PMMA-BSA粒子中位于殼層的是BSA.

圖1 PMMA-BSA納米粒子經1%的磷鎢酸染色后的TEM照片F(xiàn)ig.1 TEM image of PMMA-BSAnanoparticles stained with 1%phosphotungstic acid

圖2 PMMA-BSA粒子的全掃描X射線光電子能譜圖Fig.2 Respective XPS survey scans of PMMA-BSA particles

3.2 PMMA-BSA納米粒子在金表面的吸附過程

采用帶耗散的石英晶體微天平研究PMMABSA納米粒子在金表面的吸附過程.使用QCM-D 300型石英晶體微天平(Q-sense AB,瑞典),配有共振基頻為5 MHz,直徑為14 mm的AT-cut石英振子金片.測試過程中,先用磷酸鹽緩沖液為基準物測量獲得基線,基線穩(wěn)定后,將相應的樣品溶液替換QCM-D腔中的磷酸鹽緩沖液,實驗在(25.00± 0.02)°C下進行.

圖3 BSA和PMMA-BSA粒子的高分辨N 1s X射線光電子能譜圖Fig.3 Respective high resolution N 1s XPS spectra of pure BSAand PMMA-BSAparticles

圖4 石英振子金片浸入PMMA-BSA分散液時Δf和ΔD隨時間的變化Fig.4 Changes of frequency(Δf)and dissipation(ΔD) after gold-coated quartz resonator is immersed in a PMMA-BSAdispersion

圖4是PMMA-BSA納米粒子在石英振子金片表面吸附時,頻率和耗散因子隨時間的變化.根據QCM-D原理可知,QCM-D頻率的變化Δf直接與吸附層的質量有關,而其耗散因子的變化(ΔD)則與吸附層的厚度和結構的松散程度有關.24,25從圖中可以看出,當向QCM-D反應腔體中加入PMMA-BSA分散液時,頻率迅速下降,耗散因子快速上升,說明PMMA-BSA粒子快速地吸附到金片表面.吸附平衡時,Δf值下降達到-732 Hz,表明金片上吸附的PMMA-BSA量較多.利用磷酸鹽緩沖液反復沖洗時,Δf和ΔD沒有變化,說明PMMA-BSA納米粒子在金片上吸附較牢固.PMMA-BSA納米粒子與金片之間的較強相互作用一方面是由于粒子殼層的BSA蛋白含有氨基,另一方面BSA結構中有35個半胱氨酸殘基,其中形成了17對二硫鍵,第34位是以巰基形式存在的,26-28Maynard29,30和Bulmus31-32等的研究表明,第34位的巰基在磷酸鹽緩沖液中位于BSA蛋白外層,具有反應活性,由于巰基和二硫鍵與金都具有較強的相互作用,所以PMMA-BSA粒子可以牢固地吸附到金片表面.

從前面的討論可知,Δf反映了PMMA-BSA粒子在金片上的吸附量,而ΔD反映了吸附層的厚度和結構的松散程度.因此,通過Δf和ΔD之間的關系,我們可以更好地理解PMMA-BSA納米粒子在金片上的吸附過程.圖5是PMMA-BSA粒子在振子表面吸附時ΔD與Δf的關系.從圖中可以看出, PMMA-BSA粒子在金片表面吸附時,只包含一個動力學過程,也說明PMMA-BSA粒子在金片上的快速吸附是由粒子殼層蛋白中巰基和二硫鍵與金的強相互作用所致.從圖中還可以得出,在吸附過程的后半部分,隨著-Δf的增加,ΔD的增加變緩,使得曲線略向下彎曲,這可能是由于吸附到金片表面的PMMA-BSA粒子結構發(fā)生調整,使粒子排列更加緊密,導致吸附層結構變得更加致密.因為,對于一個被PMMA-BSA粒子覆蓋的振子來說,ΔD主要由吸附層的結構所決定.一個致密的剛性的吸附層會導致比較小的ΔD,而一個松散柔軟的吸附層會產生較大的ΔD.24

圖5 PMMA-BSA納米粒子在石英振子金片上吸附時ΔD與Δf的關系Fig.5 Relationship between ΔD and Δf after gold-coated quartz resonator adsorbed by PMMA-BSAnanoparticles

表1 pH值對PMMA-BSA粒子在石英振子金片上吸附的影響Table 1 Effect of pH values on the adsorption of PMMA-BSAparticles on gold-coated quartz resonator

圖6 PMMA-BSA納米粒子在石英振子金片表面吸附的AFM高度圖(A和B)和相圖(A?和B?)Fig.6 AFMheight(AandB)andphase(A?andB?)imagesofPMMA-BSAnanoparticlesadsorbedongold-coatedcrystalsurface(A)pH 3.6;(B)pH 7.4

表1是不同pH值下,PMMA-BSA納米粒子在金片表面吸附達到平衡時,Δf和ΔD的變化值.可以看出,改變pH值對PMMA-BSA納米粒子在金片表面的吸附量影響較大.由于頻率下降值與吸附在金片上PMMA-BSA納米粒子的質量成正比,從表中數據可以得出pH 5.5時吸附量較多,pH 7.4時吸附量稍微有所下降,而pH 3.6時吸附量較少.由于PMMA-BSA納米粒子的等電點為5.1,pH 7.4或3.6時粒子間靜電排斥力比pH 5.5時強,所以當金片上吸附一層粒子后,繼續(xù)吸附的PMMA-BSA納米粒子需要克服較強的靜電排斥力,從而導致pH 7.4時吸附量有所下降.為了更直觀反映粒子的吸附情況,我們將吸附粒子后的金片進行原子力顯微鏡(AFM)掃描,結果如圖6所示.其中圖6(A,B)對應的QCM-D實驗中吸附平衡時的Δf值分別為-119、-943 Hz.可以看出,QCM-D與AFM的實驗結果吻合較好.pH 3.6吸附平衡時頻率下降值較小,對應的粒子吸附的量較少,只覆蓋了部分石英振子金片表面; pH 7.4時石英振子金片表面吸附了多層粒子,金片表面完全被粒子覆蓋.這種吸附的差異一方面是由于粒子間靜電排斥力不同,另一方面是由于不同pH值時粒子殼層的BSA結構發(fā)生變化.BSA是一種“軟蛋白”,在不同的pH值體系里,其構象變化較大,而分子構象的改變必然導致表面一些功能基團的重新排列,使得BSA分子表面的巰基和二硫鍵發(fā)生變化,導致在不同pH值下粒子在金片上的吸附量有所不同.Radke等33對BSA結構的pH值依賴性進行了詳細的研究,結果表明pH 7.0時BSA中螺旋結構占48%;pH 5.0時螺旋結構增加到55%;當pH值降至2.7時螺旋結構僅有35%;說明在低的pH值下BSA構象變化較大,這可能導致表面的巰基和二硫鍵被包埋到分子內部,所以在pH 3.6時PMMA-BSA納米粒子在金片上的吸附量大大減少.

圖7 (A)0.3 V電位下往含5 mmol·L-1二茂鐵羧酸的磷酸鹽緩沖溶液(0.05 mol·L-1,pH 7.4)中連續(xù)滴加葡萄糖時電極的響應電流隨時間的變化;(B)連續(xù)滴加葡萄糖時響應電流隨葡萄糖濃度的變化Fig.7 (A)Current response of GOx electrode after a successive addition of glucose in pH 7.4,0.05 mol·L-1PBS containing 5 mmol·L-1FMCAunder an applied potential of 0.3 V;(B)current response as a function of glucose concentration as glucose addition successivelyThe insert in(A)is the partial enlarged graph.

3.3 在電流型葡萄糖傳感器中的應用

利用恒電位安培法,我們研究了Au/PMMABSA～GA/GOx電極對葡萄糖的響應性能.在0.3 V的工作電位下,向磷酸鹽緩沖溶液中連續(xù)加入葡萄糖,檢測催化電流與葡萄糖濃度的關系,結果如圖7所示.從圖中可以看出,每次加入葡萄糖后,響應電流會出現(xiàn)相應的跳躍性增加.通過放大的插圖可以得出,電極的響應速度較快,達到95%穩(wěn)態(tài)電流的時間僅為11 s.快速的電流響應說明PMMA-BSA納米粒子形成的修飾層對葡萄糖擴散阻力較小.隨著葡萄糖濃度的增加,電極的響應電流逐漸增大.響應電流與葡萄糖濃度在0.20-5.85 mmol·L-1范圍內呈現(xiàn)出良好的線性關系,相關系數為0.989,如圖7 (B)所示.通過響應電流與濃度的關系可計算出Au/ PMMA-BSA～GA/GOx電極的靈敏度為28.6 μA·L· mmol-1·cm-2,高于文獻中常報道的5-20 μA·L· mmol-1·cm-2的范圍.34-37高的靈敏度可使Au/PMMABSA～GA/GOx電極用于微量葡萄糖溶液的檢測,這對電極的實際應用也非常有利,可以降低測試需要的血液量,減輕取血給病人帶來的不適.傳感器還具有較低的檢測限為0.11 mmol·L-1.通過Lineweaver-Burk方程的電化學形式求得表觀的米氏常數為6.03 mmol·L-1,表明固定到電極上的GOx具有較高的活性和對底物葡萄糖有較大的親和性.38,39

傳感器的儲存穩(wěn)定性對其實際應用非常重要,而文獻中一般將制備的傳感器儲存在4°C的低溫下,考察傳感器可以使用的時間,很少有報道在接近室溫的條件下研究傳感器的使用時間.這主要是因為較高溫度下,GOx容易失去活性.這里我們在較高的溫度25°C下,考察了傳感器的儲存穩(wěn)定性,結果如圖8所示.從圖中可以看出,在22 d的時間內,傳感器的響應電流幾乎沒有發(fā)生變化.在25°C下儲存30 d時間時,響應電流僅下降了16%,說明傳感器具有良好的儲存穩(wěn)定性.傳感器在較高溫度下表現(xiàn)出的儲存穩(wěn)定性一方面歸因于GOx和PMMA-BSA納米粒子之間結合牢固;另一方面, PMMA-BSA納米粒子殼層的BSA蛋白為GOx提供了與其組成相似的生物微環(huán)境,有利于GOx結構的穩(wěn)定和活性的保持.

圖8 電極在25°C下的儲存穩(wěn)定性隨時間的變化Fig.8 Stability of GOx electrode stored at 25°Ci0is the steady-state current of the enzyme electrode freshly fabricated and i is the current after a given storage time.

4 結論

利用銅離子引發(fā)體系,制備出核層為PMMA,殼層為BSA的PMMA-BSA核殼型納米粒子. QCM-D實驗表明PMMA-BSA納米粒子可以吸附到金片表面.通過Δf和ΔD之間的關系,可以得出PMMA-BSA粒子在金片表面吸附時,只包含一個動力學過程.改變溶液的pH值對PMMA-BSA納米粒子在金片表面的吸附量影響較大,這是由于粒子間靜電排斥力和殼層BSA蛋白構象變化所致,所以可通過改變pH來調節(jié)粒子在金片表面的吸附量.利用恒電位安培法表征了Au/PMMA-BSA～GA/ GOx電極對葡萄糖的響應性能,結果表明通過粒子在金電極表面吸附制備的葡萄糖傳感器具有響應速度快和儲存穩(wěn)定性好的特點.

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