李繼剛，鄭建坡，曲占良

（河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002）

馬鈴薯StHb1蛋白的亞細(xì)胞定位

李繼剛，鄭建坡，曲占良

（河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北省微生物多樣性研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071002）

為了研究馬鈴薯StHb1蛋白的亞細(xì)胞定位情況，采用RT-PCR技術(shù)克隆到馬鈴薯StHb1基因cDNA序列，并成功構(gòu)建了StHb1基因與綠色熒光蛋白基因的融合表達(dá)載體pBI121-StHb1-GFP.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將重組載體轉(zhuǎn)化洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀察融合蛋白的瞬時(shí)表達(dá)以確定StHb1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布.結(jié)果表明StHb1蛋白主要分布于細(xì)胞核中.

非共生血紅蛋白；綠色熒光蛋白（GFP）；亞細(xì)胞定位；融合表達(dá)載體；農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化

植物界存在3種類型血紅蛋白：共生型血紅蛋白、非共生型血紅蛋白和截短型血紅蛋白，其中非共生型血紅蛋白（nsHbs）又可細(xì)分為nsHb1和nsHb2［1］.馬鈴薯中已發(fā)現(xiàn)的非共生血紅蛋白屬于類型1（即StHb1）.研究表明，nsHb1有極高的O2親和力和很低的解離常數(shù)，一般在植物體內(nèi)不承擔(dān)O2的運(yùn)輸和儲(chǔ)存功能.nsHb1為脅迫誘導(dǎo)型蛋白，在組織缺氧或低溫脅迫條件下，NO和H2O2可影響nsHb1的表達(dá)［2-5］，且已有報(bào)道，nsHb1的表達(dá)可能與植物體抗病應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)［6-7］.本實(shí)驗(yàn)室前期分析了馬鈴薯StHb1基因的表達(dá)與致病疫霉（Phytophthorainfestans）侵染及植物抗病通路信號(hào)分子NO和H2O2之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，P.infestans及外源NO和H2O2均明顯抑制馬鈴薯感、抗性品種中StHb1基因的表達(dá).

本文在以上研究的基礎(chǔ)上，以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）作為標(biāo)記基因［8］，對(duì)StHb1-GFP融合蛋白在洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行了研究，為闡明馬鈴薯StHb1基因的生物學(xué)功能及在抗病應(yīng)答機(jī)制中發(fā)揮的作用提供新的線索.

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

荷蘭十五（馬鈴薯晚疫病感性栽培品種）購自希森馬鈴薯產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司；洋蔥購自本地超市；大腸桿菌DH5α菌株、根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存；載體pBI121-GFP由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保存；MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、高保真Taq酶、限制性核酸內(nèi)切酶及DNA Marker等均購自TaKaRa（大連）公司；TRIquick Reagent購自Solarbio；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；熒光共聚焦顯微鏡（OLYMPUS，BX 53）.

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯總RNA的提取

馬鈴薯荷蘭十五塊莖經(jīng)液氮速凍后研磨，按TRIquick Reagent試劑說明書提取塊莖的總RNA.以紫外分光光度計(jì)測(cè)A260／A280比值，并以10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取總RNA的質(zhì)量.

1.2.2 馬鈴薯StHb1基因的克隆

根據(jù)GenBank已收錄的序列號(hào)為AY151389.1的核酸序列［9］，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因特異性擴(kuò)增引物，StHb1-F：5′-GCTCTAGACATCAATCATCATGA-3′（下劃線為核酸限制性內(nèi)切酶XbaI識(shí)別位點(diǎn)），StHb1-R：5′-CGGGATCCCCTTCATCTCAGT-3′（下劃線為核酸限制性內(nèi)切酶BamH I識(shí)別位點(diǎn)）.以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增.其循環(huán)參數(shù)為：預(yù)變性94℃3min，循環(huán)94℃40s，60℃40s，72℃1min，循環(huán)35次，補(bǔ)償延伸72℃10min.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用凝膠回收試劑盒回收目的DNA條帶.

1.2.3 融合表達(dá)載體的構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增獲得的目的基因StHb1的ORF序列片段與載體pBI121-GFP分別用XbaI和BamH I進(jìn)行分步雙酶切.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收StHb1基因的ORF序列片段與載體pBI121-GFP大片段DNA.利用T4DNA Ligase將2回收產(chǎn)物進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α.經(jīng)卡那霉素（Kan）抗性平板篩選，挑取單克隆提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR和酶切鑒定.陽性單克隆送北京六合華大基因股份有限公司進(jìn)行核酸測(cè)序鑒定.以Vector NTI Advance11.0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析.

1.2.4 重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》上的方法，制備農(nóng)桿菌LBA4404的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞.將重組質(zhì)粒pBI121-StHb1-GFP和空載質(zhì)粒pBI121-GFP分別電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404.通過利福平（Rif，50mg／L）和卡那霉素（Kan，50mg／L）篩選獲得陽性克隆.提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR及酶切鑒定.

1.2.5 洋蔥內(nèi)表皮亞細(xì)胞定位

參考劉海燕等［10］的方法，將含有pBI121-StHb1-GFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌按體積比1／1 000接種于5mL LB液體培養(yǎng)基（含50mg／L Rif和50mg／L Kan），28℃過夜振蕩培養(yǎng).按照1／50的比例轉(zhuǎn)接到50mL LB液體培養(yǎng)基（50mg／L Rif，50mg／L Kan和100μmol／L乙酰丁香酮（AS））上，28℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期.3 000r／min離心10min收集菌體，并重懸于含10mmol／L MgCl2和100μmol／L AS的MS液體培養(yǎng)基中.OD600調(diào)整為0.6左右.

選取新鮮洋蔥中層鱗莖，無菌環(huán)境下用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡10min后，用無菌水洗滌3～5次.將內(nèi)表皮切成1cm×1cm大小的方塊，用鑷子撕下內(nèi)表皮平鋪于MS固體培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)24h；然后，將內(nèi)表皮置于MS重懸菌液20min，用滅菌濾紙吸干表面菌液并平鋪于MS固體培養(yǎng)基中，在光周期16h／18h，25℃的條件下共培養(yǎng)1d左右.取出洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞，以MS液體培養(yǎng)基清洗并用壓片法制片.于熒光顯微鏡下觀察與拍照.同時(shí)，以空載體pBI121-GFP轉(zhuǎn)化結(jié)果作為對(duì)照.

2 結(jié)果與分析

2.1 StHb1基因的ORF序列片段的克隆

利用TRIquick Reagent試劑提取荷蘭十五（馬鈴薯感性栽培品種）塊莖的總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)A260／A280比值為1.94，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)如圖1a所示，可以清晰地看到28S與18S2條條帶且比值約為2∶1.以此總RNA為模板，通過RT-PCR技術(shù)克隆到StHb1基因的ORF序列片段（如圖1b）.其長度約為500bp，與預(yù)期大小（484bp）基本相符.

圖1 馬鈴薯總RNA及StHb1基因ORF片段的克隆Fig.1 Total RNA of potato and cloning of ORF fragment of potato StHb1gene

2.2 融合表達(dá)載體的構(gòu)建

含有目的基因StHb1的ORF序列片段和GFP基因的融合表達(dá)載體如圖2所示.

由于載體PBI121-GFP序列分析顯示XbaI與BamH I 2核酸內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)緊鄰，且2內(nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同，因此對(duì)StHb1基因的ORF序列片段與載體pBI121-GFP進(jìn)行分步雙酶切.回收產(chǎn)物以T4DNA Ligase進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α.經(jīng)抗生素（Kan）篩選后挑取單克隆提取質(zhì)粒，以特異性引物StHb1-F與StHb1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，如圖3a中所示，2和7號(hào)重組質(zhì)粒在預(yù)期大?。?84bp）處有1條明顯的特異性擴(kuò)增條帶.用HindⅢ對(duì)2和7號(hào)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定（圖3b），瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示2重組質(zhì)粒均切出與預(yù)期大?。?07bp）相符合的DNA條帶.陽性重組菌經(jīng)測(cè)序證明StHb1基因正確插入到載體pBI121-GFP中，與GFP基因形成一個(gè)1197bp長度的完全融合ORF，其編碼399個(gè)氨基酸的多肽序列，符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì).

2.3 StHb1-GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，以空載體pBI121-GFP作為對(duì)照，培養(yǎng)1d后在熒光顯微鏡下觀察.圖4b為對(duì)照組GFP蛋白的定位情況，其在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中均可以看到GFP的綠色熒光信號(hào).而將StHb1基因的ORF插入到GFP的5′端，在洋蔥細(xì)胞內(nèi)表達(dá)形成StHb1-GFP融合蛋白，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)其主要存在于細(xì)胞核中，少量存在于細(xì)胞質(zhì)中，結(jié)果如圖4d所示.

圖2 重組載體pBI121-StHb1-GFPFig.2 Recombinant vector pBI121-StHb1-GFP

圖3 重組質(zhì)粒的鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmids

圖4 StHb1-GFP在洋蔥表皮細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of StHb1-GFP in onion epidermal cells

3 討論

鑒定基因表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞中的定位對(duì)明確其生物學(xué)功能具有重要的意義.GFP因其獨(dú)特的性質(zhì)，可以作為報(bào)告基因來研究外源基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的定位、轉(zhuǎn)移及相互作用等，現(xiàn)已廣泛用于基因功能研究［10-12］.自1988年首次報(bào)道植物非共生血紅蛋白以來［13］，為闡明其生物學(xué)功能人們已做了大量的亞細(xì)胞和組織定位研究.楊禮香等［14］利用AtGLB1-GFP融合基因表達(dá)載體在洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)來研究擬南芥AtGLB1蛋白亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果表明AtGLB1-GFP融合蛋白大部分位于細(xì)胞核，少量分布于細(xì)胞質(zhì)中.曲占良等人［3］的研究也顯示棉花GhHb1-GFP融合蛋白主要分布于細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)中也存在少量的熒光信號(hào).這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Seregélyes等［15］利用免疫組織化學(xué)細(xì)胞定位技術(shù)對(duì)苜蓿MHb1蛋白細(xì)胞內(nèi)定位的研究結(jié)果基本相符.同時(shí)Ross等［16］對(duì)水稻nsHb進(jìn)行的免疫雜交組織定位分析顯示，nsHb在根冠細(xì)胞、薄壁細(xì)胞、糊粉層細(xì)胞和維管束細(xì)胞等正在分化的組織細(xì)胞中優(yōu)勢(shì)表達(dá).橡樹非共生血紅蛋白QpHb1原位雜交結(jié)果顯示其集中分布于原生木質(zhì)部、皮層細(xì)胞和原表皮［17］.

本研究通過構(gòu)建StHb1-GFP融合表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細(xì)胞，成功實(shí)現(xiàn)了StHb1蛋白的亞細(xì)胞定位研究.熒光顯微鏡觀察顯示StHb1蛋白主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，少量定位于細(xì)胞質(zhì)，該結(jié)果與楊禮香、曲占良和Seregélyes等的研究結(jié)果基本一致，暗示該基因的功能在高等植物中比較保守.今后，擬采用轉(zhuǎn)基因方法，將該基因在馬鈴薯植株中過表達(dá)或敲低表達(dá)，為進(jìn)一步明確其功能提供更多有力證據(jù).

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Subcellular localization of StHb1protein from potato

LI Jigang，ZHENG Jianpo，QU Zhanliang
（Key Laboratory of Microbial Diversity Research and Application of Hebei Province，College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China）

To identify the subcellular location of StHb1protein，a cDNA encoding nonsymbiotic hemoglobin（StHb1）was cloned fromSolanumtuberosumby RT-PCR，and fused to the 5′end of the green fluorescent protein gene to generate plant binary vector pBI121-StHb1-GFP.It was introduced into onion epidermal cells viaAgrobacterium-mediated transformation.Subcellular localization of StHb1protein was detected by fluorescent microscopy.The results showed that the StHb1-GFP fusion proteins were predominantly present in the nucleus.

non-symbiotic hemoglobin；green fluorescent protein（GFP）；subcellular localization；fusion expression vector；Agrobacterium-mediated transformation

Q789

A

1000-1565（2012）05-0523-05

2011-11-23

河北大學(xué)博士基金資助項(xiàng)目（2007-097）；河北省教育廳資助項(xiàng)目（2007412）；河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（11215529）

李繼剛（1974-），男，山東膠南人，河北大學(xué)副教授，博士，主要從事植物基因工程方面研究.

E-mail：lijigang＠hbu.edu.cn

趙藏賞）