周 華

（杭州民生藥業(yè)有限公司，浙江 杭州310011）

阿侖膦酸鈉維生素D3片用于防治和治療各種骨質(zhì)疏松癥，如絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥、男性骨質(zhì)疏松癥。維生素D3可以提高肌體對(duì)鈣的吸收，使血漿鈣的水平達(dá)到飽和程度，促進(jìn)生長(zhǎng)和骨骼鈣化，從而輔助阿侖膦酸鈉治療骨質(zhì)疏松癥。由于維生素D3對(duì)光、熱不穩(wěn)定，在空氣中氧化和光解成前、反式維生素D3和速甾醇D3等多種產(chǎn)物，故我們選取制成包合物的維生素D3干粉為原料，再與其他藥物制成復(fù)方制劑，以提高穩(wěn)定性。由于制劑中維生素D3含量極低，且以包合物形式存在，故測(cè)定難度大。本文采用正相高效液相色譜法，可在同一色譜系統(tǒng)下測(cè)定制劑中維生素D3含量及其有關(guān)物質(zhì)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2487－1525－717液相色 譜 儀；Waters510－996 液相色譜儀；色譜柱：Aglient硅膠柱（ZORBAX RX－SIL，4.6mm×250mm，5μm）；島津2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；超聲波發(fā)生器。

1.2 試藥

阿侖膦酸鈉維生素D3片（自制，每片含5 600IU，即0.14mg維生素D3，批號(hào)：20100830）；維D3干粉（10 000IU／g，DSM Nutritional Products Ltd.／瑞士，UT08120065）；維D3對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100061－200607）；對(duì)照樣品（FOSAMAX Plus D，批號(hào)：Y3335）。異丙醇、異辛烷、正己烷、二甲基亞砜均為色譜純，丁羥甲苯、正戊醇為分析純，水為注射用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定法

2.1.1 對(duì)照品貯備溶液的制備

精密稱取維生素D3對(duì)照品25mg，置100mL棕色量瓶中，加異辛烷80mL，避免加熱，用超聲處理助溶1min使完全溶解，加異辛烷至刻度，搖勻，作為貯備溶液①；精密量取5.0mL至50mL棕色量瓶中，加異辛烷稀釋至刻度，搖勻，充氮密塞，避光，0℃以下保存，作為貯備溶液②。

2.1.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

用硅膠為填充劑，正己烷－正戊醇（997∶3）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為264nm。量取維生素D3對(duì)照品貯備溶液①5mL，置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加熱1h，取出迅速冷卻，加正己烷5mL，搖勻，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8W主波長(zhǎng)分別為254nm和365nm的紫外光燈下，將石英吸收池斜放成45°，并距燈管5～6cm，照射5 min，使溶液中含有前維生素D3、反式維生素D3、維生素D3和速甾醇D3；取此溶液200μL注入液相色譜儀，測(cè)定維生素D3的峰值，先后進(jìn)樣5次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%；前維生素D3（與維生素D3的比保留時(shí)間約為0.5）與反式維生素D3（與維生素D3的比保留時(shí)間約為0.6）以及維生素D3與速甾醇D3（與維生素D3的比保留時(shí)間約為1.1）的峰分離度均應(yīng)大于1.0。

2.1.3 響應(yīng)因子測(cè)定

精密量取對(duì)照品貯備溶液②5mL，置50mL量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液；取200μL注入液相色譜儀，計(jì)算維生素D3的響應(yīng)因子f1。f1＝C1／A1。式中：C1為維生素D3對(duì)照品溶液的濃度（μg／mL），A1為對(duì)照品溶液所得色譜圖中維生素D3峰的峰面積。另精密量取對(duì)照品貯備溶液5mL置50mL量瓶中，加入2，6－二叔丁基對(duì)甲酚（BHT）結(jié)晶1粒，通氮排除空氣后，密塞，置90℃水浴中加熱1.5h，取出迅速冷卻至室溫，加正己烷至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液；取200μL注入液相色譜儀，計(jì)算前維生素D3的響應(yīng)因子f2。f2＝（C2－f1A1）／A2，式中C2為f2測(cè)定項(xiàng)下維生素D3對(duì)照品溶液的濃度（μg／mL），f1為維生素D3的校正因子，A1為混合對(duì)照品溶液所得色譜圖中維生素D3的峰值，A2為混合對(duì)照品溶液所得色譜圖中前維生素D3的峰值。

取該制劑項(xiàng)下制備的供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，按下列公式計(jì)算維生素D3及前維生素D3折算成維生素D3后的總濃度 （Ci）。Ci＝f1Ai1＋f2Ai2，式中Ai1為維生素D3的峰值，Ai2為前維生素D3的峰值。

2.2 樣品含量測(cè)定供試品溶液制備

避光操作。取阿侖膦酸鈉維生素D3片粉約一片量（約含5 600單位VD3，0.14mg），精密稱定，置于100mL棕色容量瓶中，加稀釋劑（DMSO－水10∶2，0.02%BHT）50mL，超聲10min（水浴溫度不超過(guò)30℃），使維生素D3溶解，精密加入提取液（0.02%BHT的正己烷溶液）20mL，振搖15min，離心5min（5 000rpm），取上層清液作為供試品溶液。照含量測(cè)定法測(cè)定。

2.3 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定溶液制備

避光操作。取阿侖膦酸鈉維生素D3片粉適量（約含32 000單位VD3，0.8mg）精密稱定，置于100mL棕色容量瓶中，加稀釋劑（DMSO－水10∶2，0.02%BHT）50mL，超聲10min（水浴溫度不超過(guò)30℃），使維生素D3溶解，精密加入提取液（0.02%BHT的正己烷溶液）20mL，振搖15min，離心5min（5 000rpm），取上層清液作為供試品溶液。取供試品溶液1mL，置于100mL棕色容量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。取供試品溶液和對(duì)照溶液各200μL，照測(cè)定法檢測(cè)。

2.4 專屬性試驗(yàn)

分別取維生素D3對(duì)照品、維生素D3干粉、空白輔料、阿侖膦酸鈉維生素D3片粉，分別經(jīng)過(guò)光照、高溫、酸、堿、氧化破壞后，按照有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的方法處理并進(jìn)樣。同時(shí)分別取а－生育酚及干粉的其他輔料以及空白溶劑（DMSO－水10：2，0.02%BHT）50mL，按照有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的方法處理并進(jìn)樣。結(jié)果：保留時(shí)間4min以前的為溶劑峰及空白輔料峰，不干擾含量及有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定，可以扣除。維生素D3的降解產(chǎn)物與主峰完全分離，不干擾含量及有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。檢測(cè)出的最大雜質(zhì)證明為輔料中引入的а－生育酚，含量遠(yuǎn)低于其產(chǎn)生生理活性的量，且與其他雜質(zhì)峰完全分離，可用相對(duì)保留時(shí)間定位扣除。

2.5 線性及范圍

分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用正己烷稀釋成維生素D3濃度為3.5、4.9、6.3、7、7.7、9.1、10.5μg／mL 的溶液，各溶液分別置自動(dòng)進(jìn)樣器中自動(dòng)進(jìn)樣（n＝3），記錄維生素D3峰面積。峰面積均值X對(duì)進(jìn)樣濃度Y（μg／mL）線性回歸，得回歸方程為：A＝322354C＋5597.5，r＝0.9997。

2.6 回收率試驗(yàn)

取維生素D3干粉39、56、76mg（約相當(dāng)于VD3為98、140、190μg）各3份，分別置于100mL棕色量瓶中，各加入1片量的空白輔料，加稀釋劑（DMSO－水10∶2，0.02%BHT）50mL，超聲10min（水浴溫度不超過(guò)30℃），使維生素D3溶解，精密加入提取液（0.02%BHT的正己烷溶液）20mL，振搖15min，離心5min（5 000rpm），取上層清液作為供試品溶液。取供試品溶液，照測(cè)定法測(cè)定，即得。平均回收率為98.72%，RSD為1.10%（n＝9）。

2.8 儀器精密度

取一樣品溶液置自動(dòng)進(jìn)樣器中，連續(xù)進(jìn)樣5次，日內(nèi)RSD為0.47%。

2.9 溶液穩(wěn)定性

取一樣品溶液置自動(dòng)進(jìn)樣器中，分別于0、3、6.5、9.5、12.5、15.5、20h進(jìn)樣，RSD為1.70%。

2.10 樣品含量測(cè)定及重復(fù)性試驗(yàn)

對(duì)同一樣品（20100830）連續(xù)測(cè)定6次，求得含量為100.76%，RSD為1.20%。

2.11 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

批號(hào)FOSAMAX Plus D Y3335，最大單雜為0.35%，雜質(zhì)總量0.90；自制20100830，最大單雜為0.29%，雜質(zhì)總量1.10。

3 討論

維生素D3的正己烷溶液的紫外掃描圖中的最大吸收峰為264nm，且主要雜質(zhì)的最大吸收也在264nm附近，故選擇264nm為含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。由于維生素D3干粉在生產(chǎn)過(guò)程中，外層包裹了明膠等水溶性的物質(zhì)，本文采用的稀釋劑（DMSO－水10∶2，0.02%BHT），能溶解包合材料及維生素D3，再用正己烷提取濃縮出來(lái)，以達(dá)到測(cè)定濃度的要求。而其他文獻(xiàn)中采用皂化后提取測(cè)定的方法，操作不但繁瑣，而且在皂化及提取中有部分損失，因而影響結(jié)果。本文的方法無(wú)須皂化，從而減少了處理過(guò)程中維生素D3的損耗，提高了測(cè)定的準(zhǔn)確度，回收率高，輔料無(wú)干擾，同時(shí)具有簡(jiǎn)便、快捷的特點(diǎn)。本文樣品溶液制備方法的摸索過(guò)程中，針對(duì)稀釋劑中DMSO和水的比例、超聲時(shí)間、提取液的體積、BHT的用量、振搖時(shí)間、離心時(shí)間及速度，均做了比較性試驗(yàn)，確定了最終的制備方法，提取回收率及方法回收率均較高。有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法專屬性較強(qiáng)，自制樣品與進(jìn)口對(duì)照樣品測(cè)定結(jié)果接近。

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