常海平，王敬芝，田 原，徐 杰，程建新*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北石家莊050011;2.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古呼和浩特010059)

TPX2(targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2)，是一個(gè)受細(xì)胞周期嚴(yán)格調(diào)控并在細(xì)胞有絲分裂紡錘體形成過程中發(fā)揮重要作用的微管相關(guān)蛋白［1］。近年有研究者發(fā)現(xiàn)其過表達(dá)與唾液腺癌［2］肺鱗癌［3］、乳腺癌［4］、口腔鱗癌［5］等的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。降低其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，有望成為腫瘤治療的候選靶點(diǎn)［6］。

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸與多種因素有關(guān)，TPX2是否參與其中，目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究探討TPX2在子宮頸癌中的表達(dá)情況及其與子宮頸癌臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為宮頸癌的診治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

收集河北醫(yī)科大第四醫(yī)院2009－2010年資料完整的手術(shù)切除的宮頸癌標(biāo)本79例，新鮮的宮頸癌組織，取材后迅速放入液氮灌中，保存于－80℃冰箱，所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)。宮頸癌患者年齡30～72歲，中位年齡49.5歲。鱗癌標(biāo)本62例，組織學(xué)分級(jí):Ⅰ級(jí)27例、Ⅱ級(jí)16例、Ⅲ級(jí)19例;腺癌17例，其中病理分級(jí)Ⅰ級(jí)11例，Ⅱ級(jí)5例，Ⅲ級(jí)1例。臨床分期:Ⅰ期39例，Ⅱ期36例，Ⅲ期4例。其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組17例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組62例。宮頸上皮內(nèi)瘤變 (CIN)組30例，取自病理科存檔蠟塊。年齡34～57歲，中位年齡45歲，其中CINⅠ8例，CINⅡ13例，CINⅢ9例。對(duì)照組:因子宮肌瘤作全子宮切除的正常宮頸組織15例，年齡37～65歲，中位年齡52歲，所有腫瘤標(biāo)本均在患者放、化療治療前采集并獲得患者的知情同意。

1.2 試劑

兔抗人TPX2多克隆抗體(Bioward公司)，SP試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)，引物由上海捷瑞技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)試劑盒(Fermentas公司)。宮頸腺癌HeLa細(xì)胞系(河北醫(yī)科大第4醫(yī)院科研中心細(xì)胞庫(kù))，宮頸鱗癌Siha細(xì)胞(上海中科院細(xì)胞庫(kù))，1640細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季清公司).

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

HeLa、Siha細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合至基本鋪滿瓶底時(shí)傳代。

1.4 RT-PCR方法

取100 mg組織及已鋪滿25 cm2培養(yǎng)瓶的細(xì)胞，采用Trizol總RNA提取液提取總RNA，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析其完整性，以DNA/RNA測(cè)定儀260/280 nm波長(zhǎng)處測(cè)定RNA的吸光度(A)值，以測(cè)定RNA樣品的純度和濃度。cDNA的合成按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，1μL Oligo d(T)、2μg總RNA和1μL 10 mmol/L dNTP混合物加入滅菌蒸餾水至12μL，65℃加熱5 min后，迅速置于冰上冷卻。加入4μL 5×反應(yīng)緩沖液和2μL 0.1 mmol/L DTT離心后37℃下孵育2 min，在室溫下加入1μL M-MLV，37℃孵育50 min，70℃加熱15 min以終止反應(yīng)。最后于－20℃保存待用。PCR擴(kuò)增:采用GAPDH作為內(nèi)參照，目的片段為247 bp，引物序列為;5'-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3'(上游)，5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'(下游)。TPX2目的片段為332 bp，序列為:5'-AACAATCCATTCCGTC AA-3'(上游)，5'TGCAGGTGGCATACAAGG-3'(下游)。PCR擴(kuò)增:TPX2反應(yīng)條件為:95℃變性3 min后，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35 個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸6 min。GADPH為95℃變性5 min后，95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，共25 個(gè)循環(huán)，最后72℃延仲6 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物置于1.5 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳(80 V，40 min)，采用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行掃描分析TPX2及GADPH的吸光度值。TPX2的表達(dá)量以其 A值與同一標(biāo)本GADPH的A值的比來表示。

1.5 免疫組化檢測(cè)及結(jié)果判定

采用免疫組化SP法檢測(cè):用PBS液(磷酸鹽緩沖液)取代第一抗體作陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)操作按SP試劑盒說明書進(jìn)行。切片常規(guī)脫蠟，高壓鍋130℃修復(fù)13 min，3%H2O2作用15 min消除內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清37℃封閉30 min，滴加TPX2一抗(1∶75)，4℃過夜，37℃孵育30 min，滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS洗5 min×3次，滴加三抗，37℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片。免疫細(xì)胞化學(xué)步驟:細(xì)胞爬片不進(jìn)行高壓修復(fù)，其余同免疫組化。結(jié)果判斷:根據(jù)染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度綜合評(píng)定。TPX2的陽(yáng)性表達(dá)定位于胞核。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)瘤細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比。無(wú)染色計(jì)0分;弱染色(淺黃色)計(jì)1分;中等染色(棕黃色)計(jì)2分;強(qiáng)染色(黃褐色)計(jì)3分，細(xì)胞陽(yáng)性率≤5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，25% ～50%計(jì)2分，＞50%計(jì)3分。上述二項(xiàng)相加，0分為陰性(－)，1～2分為(+)，3～4分為(++)，5～6分為(+++)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，其中免疫組織化學(xué)染色結(jié)果為等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)分析，RTPCR結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (x—±s)表示，各表達(dá)指標(biāo)的組間差異在進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 TPX2的RT-PCR檢測(cè)

正常宮頸組織中TPX2的mRNA幾乎不表達(dá)為0.080±0.030，而宮頸腺癌組織中TPX2 mRNA表達(dá)為0.467±0.031，宮頸鱗癌組織TPX2 mRNA表達(dá)為0.441±0.011，HeLa細(xì)胞的表達(dá)為1.923±0.040，Siha細(xì)胞的表達(dá)為1.679±0.042，各組與正常宮頸組織比較均有明顯差異(p＜0.01)，(圖1)。

2.2 免疫組化法檢測(cè)TPX2蛋白在不同宮頸組織及細(xì)胞中的表達(dá)

TPX2蛋白在不同宮頸組織的表達(dá) (表1)，TPX2蛋白表達(dá)定位于胞核，TPX2蛋白在CIN和宮頸鱗癌組織中表達(dá)漸增強(qiáng) (圖2A，圖2B)，但在正常宮頸鱗狀上皮未見表達(dá) (圖2C)，p＜0.05，宮頸腺癌組織呈陽(yáng)性表達(dá) (圖2D)，正常宮頸腺上皮未見表達(dá) (圖2E)。TPX2蛋白均表達(dá)于細(xì)胞核，宮頸腺癌HeLa細(xì)胞系的表達(dá)強(qiáng)于鱗癌Siha細(xì)胞系 (p＜0.05)(圖3)。

表1 TPX2蛋白在不同宮頸組織的表達(dá)Table 1 Expression of TPX2 protein in different cervical tissue

2.3 TPX2蛋白在宮頸癌的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系(表2)

TPX2蛋白在宮頸癌中，隨著病理分級(jí)增加其表達(dá)增強(qiáng)，中低分化的表達(dá)強(qiáng)于高分化(p＜0.05)，臨床分期Ⅱ，Ⅲ期強(qiáng)于Ⅰ期(p＜0.05)，有淋巴轉(zhuǎn)移組強(qiáng)于未有淋巴轉(zhuǎn)移組(p＜0.05)。尚不能證明表達(dá)強(qiáng)度與年齡有關(guān)系(P＞0.05)。

3 討論

圖1 TPX2 mRNA在宮頸癌組織和宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)Fig 1 The expression of TPX2 mRNA in cervical cancer Cell lines and cervical cancer tissue

圖2 TPX2蛋白在不同宮頸組織的表達(dá)Fig 2 Expression of TPX2 protein in different cervical tissue(×400)

表2 TPX2與宮頸癌各臨床病理因素的關(guān)系Table 2 Correlation of TPX2 expression to clinicopathologic factors of cervical carcinoma

圖3 TPX2蛋白在不同宮頸細(xì)胞系中的表達(dá)Fig 3 Expression of TPX2 protein in different cervical cancer cell lines(×400)

TPX2是一種受細(xì)胞周期嚴(yán)格調(diào)控的核增殖相關(guān)蛋白，參與細(xì)胞有絲分裂的紡錘體微管功能，它在細(xì)胞有絲分裂紡錘體的組裝時(shí)發(fā)揮重要的作用，在組裝完成后它又在維持紡錘體的完整性方面起作用［1］。它主要表達(dá)于 S期，其次是 G2期和M 期［7］。有研究者認(rèn)為它在肺癌進(jìn)展中起致癌作用，表達(dá)強(qiáng)度與肺鱗癌的臨床分期、病理分級(jí)以及是否有淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，其高表達(dá)與5年生存率的降低相關(guān)［3］。有人用RNA干擾方法抑制TPX2的表達(dá)后致細(xì)胞增殖能力降低及發(fā)生S期細(xì)胞周期停頓現(xiàn)象和細(xì)胞凋亡［6］。有研究者利用 RNA干擾技術(shù)靶向抑制TPX2用以治療小鼠胰腺癌取得了滿意的效果［8］，本研究我們發(fā)現(xiàn)，TPX2在宮頸腺癌HeLa細(xì)胞中表達(dá)極高，宮頸鱗癌Siha細(xì)胞中的表達(dá)略弱于HeLa細(xì)胞，TPX2是否在腺癌的進(jìn)展中發(fā)揮更重要的作用，還有待于進(jìn)一步研究。TPX2在正常宮頸腺上皮和鱗狀上皮均不表達(dá)，而在鱗癌和腺癌組織中卻明顯呈陽(yáng)性表達(dá)，而且隨著腫瘤分期越晚及組織病理學(xué)分級(jí)越差，TPX2蛋白的表達(dá)水平越高。TPX2蛋白的表達(dá)水平在是否有淋巴轉(zhuǎn)移的兩組中有顯著性差異，提示該蛋白是宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素，其高表達(dá)可能成為研究宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移新的分子標(biāo)志。在正常宮頸鱗狀上皮、CIN、宮頸鱗癌組織中，TPX2蛋白由不表達(dá)到表達(dá)遞增趨勢(shì)，提示TPX2可能在宮頸癌發(fā)生過程中起重要的促進(jìn)作用，監(jiān)測(cè)其表達(dá)可能成為宮頸癌及宮頸癌前病變的一種輔助診斷指標(biāo)。以TPX2為研究點(diǎn)，可能為宮頸癌的診治提供一條新的思路。

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