田海龍，李惠武，李 卉，段明軍，姜孝芳，白靖平*

(新疆醫(yī)科大學(xué)1.附屬腫瘤醫(yī)院;2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞與分子生物教研室;3.第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心，新疆烏魯木齊830000)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病率占原發(fā)顱內(nèi)腫瘤第1位。臨床針對(duì)膠質(zhì)瘤進(jìn)行手術(shù)輔助放化療的綜合治療，但治療效果并不理想。近年來發(fā)現(xiàn)Hedgehog(Hh)信號(hào)通路的異常激活在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。該通路通常通過核轉(zhuǎn)錄因子Gli-1(glioma-associated oncogene homolog 1，Gli-1)發(fā)揮作用。Gli-1成為Hh信號(hào)最終的響應(yīng)者和功能的執(zhí)行者，其核酸水平的表達(dá)是Hh通路早期活化的標(biāo)志，是整個(gè)通路最主要的環(huán)節(jié)［1－2］，Gli-1的異常高表達(dá)可能促進(jìn)膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展。

卡莫司汀(carmustine，BCNU)是治療腦腫瘤常用的藥物之一，但靜脈注射該藥對(duì)骨髓、肝臟和肺臟的不良反應(yīng)大，限制藥物的臨床應(yīng)用［3］。為探索更理想的膠質(zhì)瘤治療方法，本研究觀察siRNA聯(lián)合BCNU影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和增殖的作用效果，探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所);RPMI1640和胎牛血清(Gibco公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Trizol(Invitrogen公司);AnnexinⅤ凋亡試劑(上海晶美公司);siRNA和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(上海吉瑪公司);兔抗人 Gli-1、BCL-2、cycinD1和BAX多克隆抗體(武漢博士德公司);Western blot試劑盒及碘化丙啶(Propidiumiodide，PI)(Sigma公司);BCNU注射液(上海伊明公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞系培養(yǎng):含1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%滅活胎牛血清的RPMI1640作為培養(yǎng)基，復(fù)蘇U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞，5%CO2、37℃培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 siRNA-Gli-1合成、轉(zhuǎn)染及濃度篩選:根據(jù)人Gli-1序列(Genbank，NM_00116 0045)中轉(zhuǎn)錄RNA的作用位置及小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)設(shè)計(jì)原則，確定人Gli-1的siRNA目標(biāo)寡核苷酸序列，由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成針對(duì)Gli-1的siRNA干擾片段(Gli-1-siRNA)和陰性對(duì)照siRNA(negative control siRNA，NC)，綠色熒光素酶(FAM)標(biāo)記(FAM-siRNA)。設(shè)siRNA-Gli-1不同濃度梯度10、50、100 nmol/L各3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)6次，收集轉(zhuǎn)染6 h后的U251細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡觀察，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，篩選siRNA-Gli-1最佳濃度。

1.2.3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察:將對(duì)數(shù)生長期的U251細(xì)胞隨機(jī)分為3組:siRNA-Gli-1組(篩選后的siRNA-Gli-1干擾片段);空轉(zhuǎn)組(Lipofectamine，lipo group);空白組 (RPMI1640 group)作為對(duì)照，250μL PRMI1640稀釋的 siRNA-Gli-1，同 Lipofectamine混勻，室溫下保溫孵育20 min，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，光鏡觀察。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(半定量PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染及 BCNU處理后 Gli-1、cyclin D1、BCL-2和 BAX mRNA水平的表達(dá):隨機(jī)分組如下:BCNU組(BCNU注射液，預(yù)實(shí)驗(yàn)確定濃度為1.5 mg/L)、siRNA-Gli-1組、聯(lián)合組(combination group，siRNA-Gli-1+1.5 mg/L BCNU)、空轉(zhuǎn)組和空白組。所有引物(表1)均由上海生工公司合成。PCR產(chǎn)物用1×TBE電泳緩沖液的2%(W/V)瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/L的溴乙錠)電泳，紫外線投射反射儀下觀察結(jié)果，凝膠圖像分析儀掃描。

1.2.5 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染及BCNU處理后Gli-1、cyclin D1、BCL-2及BAX蛋白的表達(dá)水平:分組同1.2.4，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后提取總蛋白，經(jīng)Bradford法測(cè)定蛋白濃度，蛋白質(zhì)等量樣品與2×SDS凝膠加樣緩沖液混合，煮沸變性5 min;上樣蛋白為60μg，每組分別取20μg用以檢測(cè)內(nèi)參GAPDH蛋白質(zhì)，取60μg用以檢測(cè)Gli-1蛋白質(zhì)，經(jīng)12%SDS-PAGE電泳，30 V 4℃電轉(zhuǎn)移過夜轉(zhuǎn)至硝酸纖維素 (NC)膜;麗春紅S染色10 min以觀察各電泳帶蛋白質(zhì)量是否一致;4℃封閉過夜;洗膜30 min，加入用TBS稀釋的一抗 (1∶50)，GAPDH(1∶400)4℃孵育8 h;洗膜30 min，羊抗兔IgG抗體 (1∶6 000)室溫共孵育4 h，洗膜30 min;加入ECM試劑，曝光，顯影，定影，X線膠片拍照保存。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期:分組同1.2.4，消化細(xì)胞，并及時(shí)加入含血清的完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)。輕微吹打使細(xì)胞脫壁，500 r/min離心5 min收集細(xì)胞，棄上清，洗滌2次。懸浮細(xì)胞得單細(xì)胞懸液，加入純乙醇，終濃度達(dá)70%以固定細(xì)胞，置4℃過夜。離心棄乙醇，再洗滌細(xì)胞2次;加碘化丙啶染色液30μL，15 min。流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡百分比及周期。

1.2.7 甲基噻唑基四唑法(methyl thiazolyl tetrazolium assay，MTT法)檢測(cè)細(xì)胞增殖 分組同1.2.4。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度至105/mL，按2×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，終體積200 μL/孔，設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，分別于轉(zhuǎn)染后12、24、48 和72 h加人20μL MTT(5 g/L)/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h棄上清，加二甲基亞砜150μL，室溫靜置20 min，振蕩10 min至紫色結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀490 nm波長處測(cè)各孔吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變與篩選結(jié)果

當(dāng)lipofectamine∶siRNA干擾片段 =50 pmol∶5μL轉(zhuǎn)染后，倒置熒光顯微鏡觀察，從2 h開始，細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，6 h視野滿布熒光細(xì)胞(圖1A)。經(jīng)FCM檢測(cè)，siRNA-Gli-1和NC轉(zhuǎn)染的效率約為69.20% ～73.80%，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均按此比例進(jìn)行。光鏡下觀察，空白組和空轉(zhuǎn)組的U251細(xì)胞均貼壁生長，梭形或多角形，有突起;細(xì)胞均勻分布，胞膜有良好的折光性;siRNA-Gli-1組的細(xì)胞在24 h出現(xiàn)死亡，48 h死亡細(xì)胞明顯增加(圖1B)。

表1 各待測(cè)因子引物序列、擴(kuò)增長度及擴(kuò)增條件Table 1 The primer sequences，the length and condition of amplification of each factors

2.2 U251細(xì)胞中 Gli1、cyclin D1、BCL-2及 BAX的mRNA和蛋白水平表達(dá)

各組中Gli-1蛋白同mRNA表達(dá)水平基本一致(圖2)。各組中BCL-2、BAX及cyclin D1蛋白表達(dá)具有差異(圖3)。

圖3 Western blot檢測(cè)各組Gli-1、BCL-2、BAX和Cyclin D1蛋白的表達(dá)Fig 3 Detection of protein expressio of Gli-1，BCL-2，BAX and Cyclin D1 in different groups

2.3 siRNA-Gli-1聯(lián)合BCNU對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響

處理48 h后，siRNA-Gli-1組、BCNU組、聯(lián)合組與空轉(zhuǎn)組和空白組之間有顯著差異(p＜0.01);siRNA-Gli-1組與BCNU組和聯(lián)合組之間有顯著差異(p＜0.05)BCNU組與聯(lián)合組之間有顯著差異(p＜0.05)(圖4)。

2.4 細(xì)胞周期分析結(jié)果

空白組和空轉(zhuǎn)組細(xì)胞的G1期百分比含量明顯低于其他3個(gè)實(shí)驗(yàn)組;細(xì)胞的S期百分比含量與此相反(p＜0.01)(表2)。

圖4 轉(zhuǎn)染和BCNU處理48 h后各組細(xì)胞凋亡檢測(cè)Fig 4 Detection of cells apotosis in each group 48 hours after transfection and being treated by BCNU

表2 各組在不同細(xì)胞周期時(shí)段的細(xì)胞含量Table 2 The cell contents in different phases in different group

2.5 U251細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)結(jié)果

MTT法顯示12 h開始，空白對(duì)照組、空轉(zhuǎn)組A值逐步升高、24 h后升高明顯;siRNA-Gli-1組、BCNU組和聯(lián)合組48 h后緩慢升高。與空白及空轉(zhuǎn)組對(duì)比，siRNA-Gli-1 組、BCNU 組和聯(lián)合組 12、24、48、72 h細(xì)胞生長抑制率均隨時(shí)間的延長而顯著升高，24～72 h內(nèi)，聯(lián)合組細(xì)胞生長受抑制最明顯(p＜0.05)(圖4)。

圖5 各組細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果Fig 5 Detection of cells proliferation in each group on different times by MTT

3 討論

Gli-1異常激活，調(diào)控下游靶基因的異常轉(zhuǎn)錄，對(duì)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和惡性生物學(xué)特性的維持極為重要［4－5］。RNA 干擾(RNA interference，RNAi)是目前干擾基因表達(dá)研究的熱點(diǎn)，其核心是由21～25 nt雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后的基因靜默過程［6］。本研究將siRNA-Gli-1轉(zhuǎn)染于人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，沉默Gli-1表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡增加。在此基礎(chǔ)之上，聯(lián)合化療藥物BCNU，觀察對(duì)U251細(xì)胞增殖及相關(guān)因子表達(dá)的影響。BCNU不抑制Gli-1的表達(dá)，但是BCNU和siRNA-Gli-1都使得BCL-2表達(dá)降低，BAX表達(dá)上調(diào)，BCL-2/BAX比例下降。二者聯(lián)合，這一作用增強(qiáng)(p＜0.05)。研究證實(shí)，BCNU作為細(xì)胞周期非特異性烷化劑，具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，作用機(jī)制是通過影響caspase 3通路改變BCL-2和BAX的表達(dá)［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，Gli-1轉(zhuǎn)錄受到RNAi干擾后，BCL-2/BAX比例改變，造成腫瘤細(xì)胞凋亡逃逸機(jī)制失調(diào)，對(duì)BCNU的敏感性增加，促使凋亡率增高［7－8］。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA-Gli-1組、BCNU組、聯(lián)合組增加U251細(xì)胞凋亡比例，聯(lián)合組促進(jìn)凋亡的效果更為明顯(p＜0.05);同BCL-2/BAX表達(dá)的變化一致;細(xì)胞增殖的程度受Gli-1表達(dá)的影響，靶向Gli-1的siRNA-Gli-1，具有抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的作用。Gli-1調(diào)控BCL-2的表達(dá)，影響U251細(xì)胞增殖和凋亡;細(xì)胞增殖曲線顯示，siRNAGli-1和BCNU聯(lián)合顯著增加單用BCNU或siRNAGli-1對(duì)U251細(xì)胞的抑制程度(p＜0.05)，其抗腫瘤作用可能通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的促凋亡和抑制抗凋亡基因的表達(dá)雙重機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的。

作為調(diào)節(jié)G0/G1期的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，cyclin D1在膠質(zhì)瘤中過表達(dá)，與腫瘤增殖和侵襲密切相關(guān)［9］。過表達(dá)cyclin D1使G1期縮短，對(duì)分裂原的依賴性減弱，并異常啟動(dòng)S期相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，加速細(xì)胞分裂或轉(zhuǎn)化［9－10］。siRNA-Gli-1 通過干擾Gli-1的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致cyclin D1表達(dá)下調(diào)，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期從而延緩細(xì)胞增殖。沒有發(fā)現(xiàn)BCNU促進(jìn)siRNA-Gli-1下調(diào)cyclin D1表達(dá)的證據(jù)，但是siRNA-Gli-1和BCNU聯(lián)合對(duì)細(xì)胞周期抑制效果增強(qiáng)。是Hh和caspase-3信號(hào)通路表達(dá)共同增強(qiáng)的結(jié)果，還是有其他通路的參與?具體機(jī)制不清楚，需進(jìn)一步探討。

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