黃敬敬，王修珍，蔣小崗，顧振綸，郭次儀

(1.蘇州中藥研究所，2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)與病理生理學(xué)系，江蘇 蘇 州 215123)

藍(lán)萼甲素(glaucocalyxin A)是從唇形科香茶菜屬植物香茶菜Rabdosia amethystoieds(Benth)Ham中分離提取出的二萜化合物［1］。研究證明:藍(lán)萼甲素具有抗腫瘤、抗菌、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗氧化、DNA損傷保護(hù)以及細(xì)胞毒作用等多種生物活性［2］。藍(lán)萼甲素可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，如肝癌HepG2細(xì)胞株、卵巢癌HO8910細(xì)胞株、口腔鱗狀細(xì)胞癌Tb細(xì)胞株、白血病HL-60細(xì)胞株等［3］。然而，大量的文獻(xiàn)是關(guān)于藍(lán)萼甲素的體外細(xì)胞毒性，鮮見藍(lán)萼甲素抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制，如DNA損傷或引起凋亡的信號(hào)通路等文獻(xiàn)報(bào)道。本文選用的HeLa細(xì)胞為人宮頸癌細(xì)胞株，觀察藍(lán)萼甲素對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞株是否具有抑制細(xì)胞增殖的作用，初步探討其機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物 藍(lán)萼甲素(glaucocalyxin A，GLA)，購(gòu)自上海艾匯生物科技有限公司(純度≥99%;批號(hào):20100513)。溶于含有20%DMSO的三蒸水中，儲(chǔ)存液濃度50 mmol·L－1，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱，Napco 5410型，美國(guó)Napco公司。生物潔凈工作臺(tái)，YJ-1450 B型，吳江市設(shè)備凈化總廠。倒置顯微鏡，CKX41，日本OLYMPUS公司。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，DG5032型，南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限公司。流式細(xì)胞儀，EPICS XL型，美國(guó)Beckman-Coulter公司。Western blot Power-PacTMBasic，041BR76078，美國(guó) BIO-RAD 公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌HeLa細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清)中，置于37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2天傳代1次。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 MTT法檢測(cè)藍(lán)萼甲素對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度為4.5 ～5×107·L－1，100 μl每孔加入96孔板中，給藥組分別加入不同濃度的藍(lán)萼甲素，其濃度依次為2.5、5、10、20、40 μmol·L－1，每個(gè)濃度設(shè)6復(fù)孔。分別培養(yǎng)12、24、48、72 h后，每孔加入 MTT 工作液(5 g·L－1)10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，吸去上清加入DMSO 100 μl/孔，搖床震蕩10 min，使結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光吸收值(OD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按以下公式計(jì)算抑制率。抑制率/%=(1－A試驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。

2.3 透射電鏡觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，10×108·L－1接種于培養(yǎng)瓶中，設(shè)空白對(duì)照組、給藥組(10 μmol·L－1)，培養(yǎng) 12 h 后，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗兩次，胰酶消化收集細(xì)胞，加入戊二醛固定，送檢。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)藍(lán)萼甲素對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，9×108·L－1接種于培養(yǎng)瓶，設(shè)空白組、給藥組(5、10、20 μmol·L－1)，培養(yǎng) 48 h 后，胰酶消化，離心(1 000 r·min－1，5 min)，PBS 洗 2 次，加入 AnnexinV/PI避光染色10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡比例。2.5 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot) 加入不同濃度藍(lán)萼甲素后，收集HeLa細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，冰浴 30 min，12 000 r·min－1離心 30 min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度后置－80℃貯存?zhèn)溆?。配?2%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。一抗(1 ∶200)，4℃孵育過夜，二抗(1 ∶2 000)，室溫孵育1 h，顯影。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行單因素方差分析或兩樣本均數(shù)的Dunett’st檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 藍(lán)萼甲素對(duì)HeLa細(xì)胞存活率的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度的藍(lán)萼甲素分別給藥12、24、48、72 h后，HeLa細(xì)胞的存活率呈遞減趨勢(shì)。IC50軟件計(jì)算藥物作用12、24、48、72 h 的 IC50分別為(21.78±1.31)、(9.90 ±0.44)、(3.84 ±1.91)、(2.44 ±0.26)μmol·L－1，呈劑量－時(shí)間依賴趨勢(shì)。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果表明各給藥組與空白對(duì)照組間細(xì)胞抑制率差異有顯著性(P＜0.05或P＜0.01，見Tab 1和Fig 1)。

3.2 藍(lán)萼甲素對(duì)HeLa細(xì)胞損傷的細(xì)胞形態(tài)的影響 透射電鏡觀察結(jié)果:對(duì)照組HeLa細(xì)胞表面微絨毛豐富，細(xì)胞器豐富，細(xì)胞核大，核仁明顯，核染色質(zhì)電子密度低;給藥組、細(xì)胞表面微絨毛減少，核染色質(zhì)邊集，呈現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)(Fig 2)。

Tab 1Reduced viability of Hela cells after Glaucocalyxin A treatment(±s，n=6)

Tab 1Reduced viability of Hela cells after Glaucocalyxin A treatment(±s，n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group

Group Dose/μmol·L －1 OD value 12 h 24 h 48 h 72 h Control 0.406 ±0.014 0.583 ±0.54 0.0812 ±0.0751.037 ±0.157 2.5 0.370 ±0.008* 0.456 ±0.062* 0.641 ±0.090* 0.560 ±0.163*5 0.35 ±0.018* 0.361 ±0.054* 0.371 ±0.191* 0.393 ±0.086＊＊10 0.318 ±0.005＊＊ 0.257 ±0.028* 0.254 ±0.212* 0.361 ±0.062＊＊20 0.267 ±0.002＊＊ 0.208 ±0.014* 0.184 ±0.173＊＊ 0.160 ±0.24＊＊40 0.160 ±0.014＊＊ 0.158 ±0.002* 0.089 ±0.013＊＊ 0.088 ±0.003＊＊

Fig 1 Cell viability of HeLa cells by Glaucocalyxin A

Fig 2 Morphological changes detected by electron micrograph(×8 000)

3.3 藍(lán)萼甲素對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)AnnexinV/PI雙染結(jié)果(Fig 3)顯示藍(lán)萼甲素可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，隨藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡比例逐漸上升。其凋亡比例分別為(1.53±0.53)%、(18.12±8.16)%、(43.26±14.81)%、(97.28±1.76)%，結(jié)果差異有顯著性(P＜0.01)，見Fig 4。

Fig 3 Flow cytometric analysis of the apoptotic rate of HeLa cells treated by Glaucocalyxin A for 48 h by Annexin V-FITC Staining

3.4 Western blot法對(duì)相關(guān)蛋白的的檢測(cè) 宮頸癌 HeLa 細(xì)胞經(jīng)藍(lán)萼甲素 5、10、20 μmol·L－1處理24 h后，Western blot法檢測(cè)結(jié)果，隨著GLA濃度的增加，Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸降低，Bax的表達(dá)逐漸增加，Caspase-3蛋白表達(dá)增加，Caspase-9蛋白表達(dá)增加，和對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示GLA可使HeLa細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Caspase-9蛋白表達(dá)上調(diào)，Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)。

Fig 4 Apoptotic rate of HeLa cell treated by Glaucocalyxin＊＊P＜0.01 vs control group

Fig 5 HeLa cell incubated with Glaucocalyxin A for 24 h and the protein expressions of Bcl-2，Bax，Caspase-3，Caspase-9

4 討論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，在我國(guó)女性惡性生殖系統(tǒng)腫瘤中死亡率居第2位，且其發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)。一般認(rèn)為宮頸癌是一種對(duì)化療不敏感的腫瘤，目前，放療及手術(shù)治療仍是宮頸癌的主要治療手段，但由于中晚期宮頸癌癌細(xì)胞的擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移，放療及手術(shù)治療的效果仍不理想，因此，尋找毒副作用小、全身化療時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞選擇性高、作用強(qiáng)的抗腫瘤藥物已成為重要的研究目標(biāo)。中醫(yī)藥可以減輕放化療的副反應(yīng)，提高癌癥患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)患者的生存期［4］。近年來，中藥因其安全性及副作用少等特點(diǎn)已成為腫瘤醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。香茶菜中分離提取的二萜化合物——藍(lán)萼甲素已被證明具有多種癌細(xì)胞增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡的作用，但其對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的作用機(jī)制尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)通過MTT法檢測(cè)顯示，不同濃度的藍(lán)萼甲素對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的抑制呈劑量－時(shí)間依賴趨勢(shì)，提示藍(lán)萼甲素對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)通過透射電鏡結(jié)果顯示藍(lán)萼甲素可誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡的主要途徑有兩條，一條是通過胞外信號(hào)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡酶Caspase，一條是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活Caspase。Caspase家族可分為兩類，一類為啟動(dòng)者如Caspase-8、9，接受刺激后能通過自剪接而激活，然后引起Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng);另一類為執(zhí)行者Caspase-3，可直接降解胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，引起凋亡。在線粒體信號(hào)通路中，Caspase-8活化后，可使Bid裂解成兩個(gè)片段，其中含BH3結(jié)構(gòu)域的C-端片段被運(yùn)送到線粒體，與存在于線粒體膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的膜相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax的BH3結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放，細(xì)胞色素C與胞質(zhì)中的凋亡蛋白酶活化因子結(jié)合，與Caspase-9相互作用形成凋亡體而自我激活，引起下游凋亡效應(yīng)，如Caspase-3的激活，產(chǎn)生一系列的酶聯(lián)激活反應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡［5－6］。本實(shí)驗(yàn)中，Wstern blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，GLA使Bcl-2蛋白水平降低，Bax蛋白水平增高，Caspase-3蛋白水平增高，Caspase-9蛋白水平增高，Western blot結(jié)果推測(cè)GLA通過線粒體途徑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞術(shù)雙染結(jié)果、透射電鏡、Bcl-2蛋白、Bax蛋白、Caspase-3蛋白、Caspase-9蛋白水平變化說明HeLa細(xì)胞凋亡變化。

綜上所述，藍(lán)萼甲素可能通過線粒體信號(hào)通路誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞的凋亡，但其具體作用靶點(diǎn)還需進(jìn)一步確定。

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