周永清，柴 琳

(皖南醫(yī)學院 醫(yī)學三系，安徽 蕪湖 241002)

彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤(NHL)，在西方國家占成人NHL的30% ～40%，在我國等發(fā)展中國家發(fā)病率則更高一些。其在病理學特征、生物學行為和臨床表現(xiàn)上都具有顯著的異質性，是一組高度異質性B細胞惡性淋巴瘤［1］。核因子κB(NF-κB)是一種具有多向調節(jié)功能的核轉錄因子，參與多種不同細胞的增殖、凋亡相關基因及癌基因的啟動和轉錄調控，被證實與腫瘤發(fā)生、生長、侵襲、轉移和耐藥等各個階段密切相關［2］。NF-κB活化現(xiàn)象在非霍奇金淋巴瘤中較為普遍，且發(fā)現(xiàn)NF-κB 通路活化與 DLBCL 的不良預后有關［3］。JAB1通過與轉錄調節(jié)蛋白AP-1特異位點結合形成穩(wěn)定復合物，促進靶基因的反式激活，參與許多細胞信號轉導通路，包括調節(jié)整合素信號、細胞周期調控和甾體類激素的信號轉導等。JAB1在實體腫瘤中研究較多，而在淋巴瘤中的研究報道較少［4，5］。出核因子-1(CRM1)是真核細胞中最重要出核轉運蛋白之一，能夠識別細胞核內某些具有核定位序列和(或)核輸出信號的蛋白分子，并與之特異性結合，介導生物大分子的出核轉運。本文應用免疫組化技術檢測 DLBCL中 NF-κBp50和 JAB1、CRM1的表達，探討三者在非霍奇金淋巴瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用以及對診斷、分型的意義。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集南京軍區(qū)南京總醫(yī)院病理科2006年6月～2010年5月DLBCL存檔石蠟組織標本94例，男性56例，女性38例;年齡14～84歲，平均年齡(54±17)歲;結內30例，以頭頸部、腋下、腹股溝等淺表淋巴結為主;赤結外64例，以胃腸道為主;其次是扁桃體、乳腺、骨組織等，其中在結外特殊部位中原發(fā)于中樞神經系統(tǒng)17例，縱隔2例。按照2008年WHO淋巴瘤分類［6］將DLBCL分為GCB型24例，non-GCB型68例，CD5+型2例。另外選取10例反應性增生的淋巴組織作為對照。

1.2 主要試劑 兔抗人多克隆抗體NF-κBp50為SantaCruz公司產品，稀釋濃度1∶50，購自北京中杉金橋生物技術有限公司，兔抗人JAB1多克隆抗體為BD公司生產，CRM1多克隆抗體SantaCruz公司產品，稀釋濃度1∶200，均購自江蘇希望生物科技有限公司。

1.3 方法 采用SABC免疫組化染色法，石蠟標本制成3～4 μm的切片，常規(guī)烘烤、二甲苯及乙醇脫蠟至水，加3%H2O2滅活內源性過氧化物酶，浸泡于枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中，高壓加熱行抗原修復，滴加5%BSA封閉液，滴加一抗放冰箱4℃冷藏過夜，次日依次滴加生物素化二抗、SABC復合物、DAB顯色，蘇木精復染，經乙醇及二甲苯脫水透明后封固。以PBS液代替一抗作陰性對照，乳腺癌切片作為陽性對照。

1.4 結果判定 NF-κBp50主要定位于淋巴細胞的細胞核和胞質，JAB1、CRM1的免疫染色主要定位于淋巴細胞的細胞核、少數胞質陽性。根據腫瘤細胞陽性表達染色強度和陽性細胞數百分比評分，染色強度評分:無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分(細胞著色深淺需與同一切片背景著色內對照)。陽性細胞數百分比評分:陰性為0分，≤10%為1分，11% ～50%為2分，51% ～75%為3分，≥76%為4分。兩積分相乘，0～3分為陰性(－)，3～6分為弱陽性(+)，6～9分為中等陽性()，9～12分為強陽性()。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。計數資料采用 χ2檢驗;等級相關性采用Spearman等級相關分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NF-κBp50、JAB1 和 CRM1 在淋巴結反應性增生和DLBCL中的表達 10例淋巴結反應性增生中NF-κBp50僅表達于濾泡生發(fā)中心和副皮質區(qū)少量免疫母細胞(圖1a)，JAB1和CRM1在濾泡生發(fā)中心部分細胞弱陽性表達，而在套區(qū)小淋巴細胞、副皮質區(qū)的小淋巴細胞不表達(圖 1b、1c)，NF-κBp50、JAB1和CRM1在淋巴結反應性增生中的陽性表達率分別為 30.0%(3/10)、40.0%(4/10)和 30.0%(3/10)。NF-κBp50、JAB1 和 CRM1 在 DLBCL 中的陽性表達均主要位于細胞核，陽性表達率分別為70.2%(66/94)、77.7%(73/94)和 69.1%(65/94)(圖 2a～c)。NF-κBp50、JAB1 和 CRM1 在 DLBCL中的陽性表達率均明顯高于淋巴結反應性增生，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 DLBCL 中 NF-κBp50、JAB1 和 CRM1 的表達與臨床病理指標之間的關系(表1)由表1可知，NF-κBp50在GCB型中的陽性表達率低于non-GCB型，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。JAB1和CRM1與DLBCL的病理亞型均無相關性(P＞0.05)。NF-κBp50、JAB1和CRM1與患者性別、年齡、發(fā)病部位及特殊部位方面的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

圖1 NF-κBp50、JAB1、CRM1在淋巴結反應性增生中表達a.NF-κBp50在淋巴結反應性增生中表達 IHC(×100);b.JAB1在淋巴結反應性增生中表達IHC(×100);c.CRM1在淋巴結反應性增生中表達IHC(×100)Fig 1 NF-κBp50、JAB1 and CRM1 are positively expressed in case of reactive hyperplasia lymph nodea.NF-κBp50 is positively expressed in case of reactive hyperplasia lymph node IHC(×100);b.JAB1 is positively expressed in case of reactive hyperplasia lymph node IHC(×100);c.CRM1 is positively expressed in case of reactive hyperplasia lymph node IHC(×100)

圖2 NF-κBp50、JAB1、CRM1 在 DLBCL 中表達a.NF-κBp50在 DLBCL中表達 IHC(× 200);b.JAB1在 DLBCL中表達 IHC(×200);c.CRM1在DLBCL中表達IHC(×200)Fig 2 Positive expression of NF-κBp50、JAB1 and CRM1 in case of DLBCLa.Positive expression of NF-κBp50 in case of DLBCL IHC(× 200);b.Positive expression of JAB1 in case of DLBCL IHC(× 200);c.Positive expression of CRM1 in case of DLBCL IHC(×200)

表1 DLBCL中NF-κBp50、JAB1和CRM1的表達與臨床病理指標之間的關系Tab 1 NF-κBp50，JAB1 and CRM1 expression in DLBCL and clinicopathologic indictors

2.3 DLBCL 中 NF-κBp50 的表達與 JAB1、CRM1 表達的相關性(表2)根據表2可以看出，NF-κBp50和JAB1在DLBCL中的表達呈正相關(rs=0.209，P＜0.05)。同樣，DLBCL 中 NF-κBp50 和 CRM1 的表達也呈正相關(rs=0.270，P ＜0.01)。

表2 DLBCL中NF-κBp50的表達與JAB1、CRM1表達的相關性Tab 2 Correlation of NF-κBp50，JAB1 and CRM1 expression in DLBCL

3 討論

DLBCL是最常見的一種 NHL，因其在病理特征、生物學行為和臨床表現(xiàn)方面具有顯著異質性，WHO將其分成非特指性(NOS)、特殊亞型和獨立疾病三類［6］。Hans等［7］依據 CD10、Bcl-6、MUM1、CD5等免疫表型將DLBCL分為GCB型、non-GCB型和CD5+型三個亞型，其中GCB型預后好于non-GCB型和CD5+型。此外WHO還分別列出如中樞神經系統(tǒng)、皮膚、縱隔等特殊部位，以及EBV、HHV8等病毒或感染相關的特殊亞型和獨立疾病［8］。

NF-κB是一種核轉錄因子的蛋白質分子，廣泛存在于細胞胞質中，目前已確認有 NF-κB1(p50/p105)，NF-κB2(P52)，RelA(P65)，RelB 和 c-Rel五個家族成員。其活性形式常見為異源二聚體p65/p50，其次是同源二聚體p50/p50和p65/p65。在靜息狀態(tài)下，與抑制蛋白 IκB 組成 NF-κB/IκB無活性的三聚體形式，而 IκB 在細胞中主要有 IκB α、γ、δ、ε、bcl-3等，作用是阻止NF-κB進入胞核，使其不能與DNA結合，同時可降解NF-κB-DNA聚合物。但在某些因素刺激下IκB被IκB激酶(IKK)磷酸化后降解，NF-κB被激活，其活化物 NF-κBp50由胞質向胞核轉移，并與DNA間特異性結合，參與多種疾病不同階段的細胞因子、生長因子及細胞粘附因子等一系列基因調控，已有證據表明NF-κB與腫瘤的發(fā)生密切關系［9］。Davis等［10］研究發(fā)現(xiàn)活化 B 細胞樣DLBCL細胞系中具有較高的NF-κB DNA結合活性，而在生發(fā)中心B細胞樣DLBCL細胞系中卻沒有，提示這兩種亞型DLBCL具有不同的發(fā)病機制。我們的實驗結果顯示，NF-κBp50在淋巴結反應性增生中僅表達于濾泡生發(fā)中心和副皮質區(qū)散在的免疫母細胞，陽性表達主要在細胞質中，而在DLBCL，尤其是non-GCB型中的表達明顯高于GCB型，且陽性表達位于腫瘤細胞胞質和胞核中，提示NF-κBp50必須進入細胞核才可激活，且其活化是non-GCB型DLBCL發(fā)病所必需的。

JAB1即C-JUN激活區(qū)結合蛋白1(C-JUN activation domain-binding protein 1，JAB1)，又名 COP9 信號體第 5亞單位(COP9 signalosome subunit 5，CSN5)，是1996年 Claret等［11］運用酵母雙雜交系統(tǒng)從人淋巴細胞cDNA文庫中篩選到的一種蛋白，其位于染色體8q13，是38 ku左右的可溶性核蛋白;在動、植物中均具有高度保守性，而人類JAB1則被定義為轉錄因子AP-1(activator protein 1)的共活化物，不僅調節(jié)AP-1轉錄活性，參與細胞增殖的調控;還與COP9信號體的亞單位相互作用，參與COP9復合體介導的激酶活性［12］，這些活動可能會引發(fā)26S蛋白酶體介導的p105，IкB經過泛素-蛋白酶體途徑，使IкB，p105 及 NF-кB 前體磷酸化，p105 轉變成 p50，即激活NF-кB。我們的實驗結果發(fā)現(xiàn)JAB1在反應性增生的淋巴結中表達很弱，而在DLBCL中表達增強，陽性信號主要位于腫瘤細胞胞核、少量在胞質，表明在DLBCL中JAB1基因被激活。同時相關分析顯示 DLBCL中 NF-κBp50與 JAB1呈正相關，但JAB1在DLBCL中的表達與性別、年齡、部位、特殊部位及病理亞型之間均無相關性，表明JAB1可能協(xié)同NF-κBp50參與DLBCL的發(fā)生和發(fā)展。

CRM1即出核因子-1(chromosome region maintenance 1)，又稱為XPO1(Exportin-1)。CRM1不僅在真核細胞有絲分裂中具有保持染色體結構功能的作用，而且發(fā)現(xiàn)在核內大分子輸出上具有重要作用，其在真核生物中保守性很強。細胞內許多蛋白可能定位在胞核或依賴能量在核質間穿梭而跨膜轉運，CRM1可能介導RNA和這些目的蛋白的核輸出。已有研究表明，IκB家族主要通過對NF-κB二聚體中NLS的掩飾，從而實現(xiàn)對NF-кBp50入核的抑制;但最常見的IκBα卻只能掩飾NF-κB兩個NLS中的一個，故還有一定量無 DNA結合活性的 NF-κB-IκBα可能趁機進入胞核內;為了保證胞核內的穩(wěn)定，此時CRM1則識別并結合這些帶有一段NLS的IκBα，形成出核轉運復合體而被輸出核外。CRM1在淋巴瘤中的研究甚少。本實驗中同樣發(fā)現(xiàn)CRM1在反應性增生的淋巴結中基本不表達，而在DLBCL中表達主要在腫瘤細胞胞核，且與NF-κBp50呈正相關，該結果提示CRM1不僅參與了DLBCL的發(fā)生，而且也協(xié)同NF-κBp50參與了DLBCL的發(fā)生發(fā)展。但CRM1在DLBCL中的表達與性別、年齡、部位和特殊部位及病理亞型之間無關，提示CRM1僅參與DLBCL的發(fā)生，而與其惡化進展無關。

大量研究表明DLBCL中GCB型5年生存率明顯高于 non-GCB型，而 NF-κBp50在 non-GCB型中的表達明顯高于GCB型。同時JAB1、CRM1二者主要通過對NF-κB出核運轉和激活發(fā)揮正向調節(jié)作用，故 NF-κB p50和 JAB1、CRM1可作為 DLBCL 發(fā)生、發(fā)展和預后較為可靠參考指標，為DLBCL的臨床個性化分子靶向治療提供可行性依據。

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