劉玉梅，劉 飛，孫艷琪，張立華，董俊余，趙麗霞，范秀麗，劉國(guó)英，盧永干

(1.金宇保靈生物藥品有限公司，呼和浩特 010030;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730046)

對(duì)于口蹄疫疫苗，其完整粒子(146S)是疫苗中最主要的抗原成分。146S在特定條件下分布在特定濃度的介質(zhì)中，可于259 nm處產(chǎn)生最大紫外吸收峰(用OD259值表示)，并且OD259值與146S濃度成正比。蔗糖密度梯度法即將口蹄疫病毒樣品置于蔗糖密度梯度上離心，在離心力的作用下，樣品中所有的完整病毒粒子均沉降到相應(yīng)的密度梯度層內(nèi)。將已知的完整病毒粒子經(jīng)蔗糖梯度離心后，在8至11級(jí)份層經(jīng)紫外分光光度計(jì)259 nm檢測(cè)時(shí)有最高吸收峰，而在其他級(jí)份層沒(méi)有吸收峰。收集146S吸收峰級(jí)份，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，即可對(duì)146S含量進(jìn)行定量。

146S定量檢測(cè)早在20世紀(jì)80年代即被OIE推薦使用，目前仍是OIE及南美一些國(guó)家和地區(qū)國(guó)際口蹄疫抗原庫(kù)每年定期監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)各類(lèi)口蹄疫抗原的主要手段。2008年，金宇保靈生物藥品有限公司懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)口蹄疫滅活疫苗獲得成功，其中采用密度梯度離心法定量146S檢測(cè)技術(shù)是成功的核心技術(shù)之一，解決了口蹄疫滅活病毒液無(wú)法準(zhǔn)確定量的技術(shù)難題。本試驗(yàn)對(duì)密度梯度定量146S的特異性進(jìn)行了研究。

1 材料

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)基 BBSM細(xì)胞培養(yǎng)基3批，每批10000 mL。

1.2 細(xì)胞液 用BBSM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞后收獲細(xì)胞液(不含病毒成份)3批，每批100 mL。

1.3 FMDV純化滅活抗原液 取口蹄疫病毒毒價(jià)LD50≤10－7.5/0.2 mL 的病 毒液 3 批，批號(hào) 為M021029、M022030、M024031，經(jīng)常規(guī)純化滅活后備用，每批100 mL。

1.4 146S抗原 共3批，批號(hào)分別為 YZ02010、YZ02011、YZ02012，每批 5 mL。

1.5 化學(xué)試劑 PEG－6000、蔗糖、PBS液等。

1.6 儀器設(shè)備 日立超速冷凍離心機(jī)、貝克曼高

速冷凍離心機(jī)、瓦里安紫外分光光度計(jì)。

2 方法

2.1 蔗糖密度梯度定量146S檢測(cè)方法 首先3000 r/min離心處理病毒液10 min除去雜蛋白;按3% ～10%(W/V)量分別加入PEG，攪拌4 h后過(guò)夜，以10000 r/min離心60 min，棄去上清，用0.04 mol/L PBS液重懸至原體積的1/8～1/12，得到病毒濃縮液，置于2～8℃冰箱中備用。制備15% ～45%均勻線性蔗糖梯度，對(duì)所述病毒濃縮液進(jìn)行蔗糖密度梯度超速離心，利用用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD259值，根據(jù)公式，計(jì)算 146S 的含量［1－2］。

2.2 純化146S滅活抗原酸解試驗(yàn)

2.2.1 146S裂解方法 每批提純146S抗原等量吸取4 份，用 pH 值7.6、pH 值 6.0、pH 值 5.0、pH 值4.0 的0.04 mol/L PBS 緩沖液25 ℃處理2 h，同時(shí)設(shè)立PBS空白對(duì)照，應(yīng)用蔗糖密度梯度離心，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD259值，把吸收峰消失與PBS空白對(duì)照基本一致樣品pH值確定為146S裂解條件［3－4］。

2.2.2 抗原裂解前后146S含量檢測(cè) 取待檢樣品30 mL，按照蔗糖密度梯度檢測(cè)方法，將其離心處理后，取上清20 mL分成2份濃縮沉淀病毒液，棄去上清，一份沉淀用0.04 mol/L pH值7.6的PBS重懸為1 mL，另一份沉淀用146S裂解條件下的PBS溶液重懸為1 mL，同時(shí)設(shè)立PBS空白對(duì)照，應(yīng)用蔗糖密度梯度離心，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD259值，計(jì)算146S的含量。

2.3 細(xì)胞液干擾試驗(yàn) 為進(jìn)一步驗(yàn)證蔗糖密度梯度離心法定量146S的特異性，對(duì)不含病毒的細(xì)胞液按照蔗糖密度梯度離心法進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證能否在8至11級(jí)份檢測(cè)到峰值。取純化滅活處理后細(xì)胞液15 mL，按照蔗糖密度梯度檢測(cè)方法，將其離心處理后，濃縮沉淀，棄去上清，沉淀用0.04 mol/L pH值7.6的PBS重懸，同時(shí)設(shè)立PBS空白對(duì)照，經(jīng)蔗糖密度梯度離心后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD259值。

3 結(jié)果

3.1 146S裂解試驗(yàn)結(jié)果 3批提純146S抗原經(jīng)四種不同pH值PBS酸解處理后的146S含量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，蔗糖密度梯度離心后紫外檢測(cè)8～11級(jí)份OD259值曲線圖見(jiàn)圖1－圖3。

表1 提純146S抗原酸解后的146S含量測(cè)定

圖1 YZ02010純化146S抗原OD值檢測(cè)分布圖

圖2 YZ02011純化146S抗原OD值檢測(cè)分布圖

圖3 YZ02012純化146S抗原OD值檢測(cè)分布圖

可以看出，3批抗原均在pH值7.6時(shí)可檢測(cè)到FMD完整病毒粒子，而在pH值6.0以下時(shí)FMD病毒完整粒子破解，不能檢測(cè)到相應(yīng)的OD259值，與PBS空白對(duì)照一致。

3.2 蔗糖密度梯度法檢測(cè)滅活病毒液裂解前后146S含量結(jié)果 M021029、M022030、M024031三批滅活抗原液裂解前146S含量分別達(dá)1.77、6.60、3.67 μg/mL，裂解后 146S 峰值消失，檢測(cè)不到146S含量，與PBS空白對(duì)照一致。

3.3 細(xì)胞液及對(duì)照相同批次病毒抗原液146S含量檢測(cè) 結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 細(xì)胞液及相同批次細(xì)胞接種病毒后病毒抗原液146S含量

可以看出，細(xì)胞液對(duì)146S沒(méi)有干擾，檢測(cè)到的8至11級(jí)份峰值應(yīng)該是由真實(shí)口蹄疫病毒粒子146S組成。

4 分析與討論

4.1 提純的146S抗原，經(jīng)蔗糖密度梯度離心法檢測(cè)，在8至11級(jí)份OD259有最大吸收峰，符合146S特性。選擇 pH6.0、pH5.0、pH4.0 PBS 酸解處理提純的146S后，8至11級(jí)份OD259峰值均消失，146S由酸解前的 1.77、6.60、3.67 μg/mL 至酸解后完全不能檢測(cè)到，說(shuō)明經(jīng)酸解后146S已裂解，同時(shí)也初步證明蔗糖密度梯度離心法檢測(cè)的抗原8至11級(jí)份峰值是由146S組成的。考慮到酸性過(guò)強(qiáng)會(huì)引起蛋白質(zhì)變性和凝聚，建議采用pH值6.0緩沖液進(jìn)行酸解。

4.2 按照蔗糖密度梯度離心法，對(duì)不含病毒的細(xì)胞液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果3批細(xì)胞液在8至11級(jí)份均沒(méi)有明顯吸收峰，而且其 OD259值與PBS空白對(duì)照OD259值基本平行一致，說(shuō)明利用蔗糖密度梯度離心法檢測(cè)口蹄疫病毒抗原，不含病毒的細(xì)胞液對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有明顯干擾，即檢測(cè)到的抗原樣品8至11級(jí)份峰值均是由146S組成，進(jìn)一步驗(yàn)證蔗糖密度梯度法測(cè)得146S具有很好特異性。

4.3 該檢測(cè)方法不但特異性好，而且快速、準(zhǔn)確、直觀、穩(wěn)定、設(shè)備簡(jiǎn)單易于操作，1～3日內(nèi)就可完成檢驗(yàn)，可精準(zhǔn)計(jì)量口蹄疫病毒粒子數(shù)量，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)偏差不高于0.2 μg/mL，易于推廣使用。尤其通過(guò)對(duì)成品疫苗146抗原含量的測(cè)定，可精確反映疫苗有效抗原水平，有望替代PD50動(dòng)物攻毒方法，降低生物安全隱患，意義重大。該方法可用于口蹄疫企業(yè)生產(chǎn)檢驗(yàn)，也可應(yīng)用于各級(jí)獸醫(yī)監(jiān)督、管理部門(mén)對(duì)疫苗的評(píng)估和評(píng)價(jià)工作。

［1］ Fayet M T，F(xiàn)argeaud D，Louisot P，et al.Physical chemical measurement of 140S particles of the foot and mouth disease virus［J］.Ann Inst Pasteur(Paris)，1971，121(1):107 －118.

［2］ Doel T R，F(xiàn)letton B W，Staple R F.Further developments in the quantification of small RNA viruses by UV photometry of sucrose density gradients［J］.Dev Biol Stand，1981，50:209 －219.

［3］ 謝慶閣.口蹄疫［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004.

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