陳啟友，廖雪玲，趙永達(dá)，楊 剛，方秋華，章 敏，黃顯會(huì)

(1.湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，長(zhǎng)沙 410006;2.上海公誼獸藥廠，上海奉賢 201401;3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/國(guó)家殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642)

頭孢噻呋是畜禽專用第3代頭孢菌素，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)的特點(diǎn)，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌及一些厭氧菌都有很強(qiáng)的抗菌活性，目前已被美國(guó)、日本和歐洲一些國(guó)家正式批準(zhǔn)用于肉牛、奶牛、馬、豬、羊、雞等細(xì)菌性疾病，如豬細(xì)菌性呼吸道感染和雞的大腸桿菌、沙門氏菌的感染等方面的治療，顯示了廣闊的應(yīng)用前景［1－2］。

近幾年，新型獸藥的應(yīng)用極大地促進(jìn)了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。頭孢噻呋因其顯著的療效，被諸多企業(yè)開發(fā)。本文進(jìn)行了兩種頭孢噻呋注射液在豬體內(nèi)的比較藥動(dòng)學(xué)研究，為獸醫(yī)臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 12頭健康的杜洛克×長(zhǎng)白×約克夏雜交豬，公母各半，體重(26.39 ±2.83)kg，購(gòu)自廣東省原種豬場(chǎng)。按常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水和采食，飼料為全價(jià)日糧，不含任何抗菌藥物。臨床觀察兩周表現(xiàn)健康。試驗(yàn)前16 h起及給藥后4 h期間禁食，僅自由飲水。

1.2 藥品與試劑 供試藥品:長(zhǎng)效鹽酸頭孢噻呋注射液，含量10%(100 mL:10 g)，批號(hào)100720，由上海公誼獸藥廠提供。對(duì)照藥品:鹽酸頭孢噻呋注射液(速解靈注射液)，含頭孢噻呋5%(100 mL:5 g)，批號(hào):0A4SM，美國(guó)輝瑞(動(dòng)物保健品)有限公司生產(chǎn)。頭孢噻呋對(duì)照品:含量87.5%，批號(hào):K0330406，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。二硫赤蘚糖醇(DTE):批號(hào)BM0462－2，SIGMA公司。碘乙酰胺(Iodoacetamide):批號(hào) I6125，SIGMA公司。乙腈:色譜純，德國(guó)CNW公司。水:符合GB/T6682規(guī)定的二級(jí)水。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器設(shè)備 美國(guó)Waters公司超高效液相色譜儀(配紫外檢測(cè)器、四元泵、脫氣泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱等);電子分析天平:FA2004N型，上海精密科學(xué)儀器有限公司。旋渦混合儀:XW－80A型，上海青浦瀘西儀器廠。高速離心機(jī):美國(guó)Thermo公司。軌道式搖床:KS501digital型，德國(guó)IKA公司;MCX小柱:MCX BondElut Varian 1CC 100MG，批號(hào)171069，德國(guó)CNW公司。

1.4 給藥與血樣采集 12頭豬隨機(jī)分為兩組，每組6頭，分別進(jìn)行肌注長(zhǎng)效鹽酸頭孢噻呋注射液(上海公誼)和肌注速解靈注射液(美國(guó)輝瑞)，給藥劑量均為5 mg/kg。豬只仰臥保定，分別于頸部肌肉注射，給藥前采一次空白血。肌肉(頸部)注射給藥后分別于 5、10、15、30 min 及 1、2、3、4、6、8、12、16、24、36、48、60、72、96、120、144、168、192 h 采集血樣，每次約5 mL，置于含肝素的離心管中，4000 r/min離心10 min，分離血漿，－20℃冰箱保存，待測(cè)。

1.5 血漿樣品預(yù)處理 血漿樣品自然解凍，搖勻。準(zhǔn)確量取血漿1.0 mL于15 mL離心管中，加入2.5 mL DTE工作液，漩渦混合1 min，50℃水浴振蕩20 min;放置室溫下降溫;加入1 mL碘乙酰胺工作液，旋渦10 s，用錫紙包好置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中30℃200 r/min培育30 min;加200 μL 20%的磷酸酸化后，加2.5 mL水混合均勻;7000 g離心20 min;取上清液備用。

往MCX小柱中依次加入3 mL色譜甲醇，3 mL水活化凈化小柱，棄去流出液;加入上述上清液，棄去流出液;再依次加入3 mL水，3 mL甲醇淋洗，真空抽干4 min;加入1 mL 1 mol/L醋酸胺:乙腈(85+15，V/V)混合液洗脫;將洗脫液用 0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，上UPLC儀測(cè)定。

1.6 色譜條件 色譜柱:Waters ACQUITY BEH RP18(2.1 mm ×50 mm，1.7 μm)，柱溫:25 ℃，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng):265 nm，流速:0.5 mL/min，進(jìn)樣量:10 μL，流動(dòng)相:0.2%三氟乙酸(A)+乙腈(B)，梯度洗脫，見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 采用美國(guó)Pharsight公司藥動(dòng)學(xué)軟件 Winnonlin5.2.1的非房室模型來(lái)處理藥動(dòng)數(shù)據(jù)，計(jì)算出每頭試驗(yàn)豬的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，然后計(jì)算平均值()及標(biāo)準(zhǔn)差(s)，同時(shí)以血藥濃度平均值對(duì)時(shí)間作藥－時(shí)曲線圖。所得藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，采用SPSS 16.0進(jìn)行t檢驗(yàn)，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 色譜條件適用性 在本試驗(yàn)建立的色譜條件下，基線平穩(wěn)，頭孢噻呋衍生物去呋喃羰基頭孢噻呋乙酰胺(DCA)與血漿中組分分離良好，DCA的色譜峰保留時(shí)間分別為3.29 min左右。本方法可獲得較好的峰形，保留時(shí)間穩(wěn)定(圖1)。

圖1 頭孢噻呋衍生化UPLC色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限 經(jīng)UPLC測(cè)定，以峰面積(A)對(duì)藥物濃度(C)回歸，得回歸方程 A=25247C+269.12，r=0.9992。頭孢噻呋衍生物去呋喃羰基頭孢噻呋乙酰胺與頭孢噻呋添加量之間在0.05～20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。檢測(cè)限數(shù)據(jù)滿足藥動(dòng)學(xué)研究要求。在上述條件下，頭孢噻呋的檢測(cè)限為0.02 μg/mL。血漿中頭孢噻呋的平均回收率76.63% ～93.61%，本方法批內(nèi)變異系數(shù)為1.46% ～7.37%，批間變異系數(shù)為6.16% ～8.05%。

2.3 回收率測(cè)定 頭孢噻呋在添加濃度0.1、1、10 μg/mL的平均回收率分別為(92.37±4.30)%、(76.63% ±4.94)%、(93.61% ±7.54)%(n=5)，方法回收率高，符合生物樣品測(cè)定要求。

2.4 精密度測(cè)定 0.1、1、10 μg/mL 頭孢噻呋藥物濃度的日內(nèi)RSD均小于8%，日間RSD均小于9%(表2)，符合精密度要求，測(cè)定方法可靠。

2.5 血漿中的藥物濃度和主要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù) 肌肉注射頭孢噻呋注射液和速解靈注射液后，血藥濃度－時(shí)間曲線圖見(jiàn)圖2。

表2 頭孢噻呋在豬血漿中UPLC色譜分析的變異系數(shù)(n=6)

圖2 兩種鹽酸頭孢噻呋注射液豬單劑量(5 mg/kg)肌注后血漿藥-時(shí)曲線

豬單劑量肌注頭孢噻呋注射液和肌注速解靈注射液的藥時(shí)數(shù)據(jù)最佳模型為非房室模型，頭孢噻呋注射液和肌注速解靈注射液后藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 兩種頭孢噻呋注射液主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較

通過(guò)表3中的各項(xiàng)平均藥動(dòng)學(xué)參數(shù)可以看到，健康豬肌注長(zhǎng)效鹽酸頭孢噻呋注射液5 mg/kg后，吸收較慢，注射給藥后11.67 h，血藥濃度達(dá)峰值，Cmax為8.16 μg/mL。血漿中平均消除半衰期(t1/2)為20.05 h;AUC 為 292(μg·h)/mL，平均滯留時(shí)間(MRT)為31.7 h;肌注速解靈注射液5 mg/kg后，吸收迅速，肌肉注射給藥后2.67 h，血藥濃度達(dá)峰值，Cmax為21.92 μg/mL，t1/2為 18.31 h;AUC 為 296.83(μg·h)/mL，MRT 為17.76 h。

3 討論與結(jié)論

3.1 最佳房室模型的選擇 根據(jù)國(guó)外已有報(bào)道，頭孢噻呋的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)大都采用非房室模型分析［3－17］。采用 3P97藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算程序，Marquardt法對(duì)一、二、三房室分別以權(quán)重1、1/C、1/C2等3種情況進(jìn)行計(jì)算，AIC值愈小，則認(rèn)為該模型擬合愈好［18］。在微機(jī)電腦上處理實(shí)測(cè)血漿頭孢噻呋血藥濃度－時(shí)間數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示，頭孢噻呋注射液和肌注速解靈注射液的血藥濃度數(shù)據(jù)均不能擬合出合適的生理模型。因此采用非房室模型的分析方法，計(jì)算出有關(guān)藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

3.2 肌注長(zhǎng)效鹽酸頭孢噻呋注射液藥動(dòng)學(xué)特征經(jīng)肌肉注射給藥結(jié)果表明，健康豬肌注長(zhǎng)效鹽酸頭孢噻呋注射液5 mg/kg后，吸收較慢，給藥后11.67 h，血藥濃度達(dá)峰值，與 Brown 等［4］的研究結(jié)果(tmax=0.33 h)相比，達(dá)峰時(shí)間顯著延長(zhǎng);但達(dá)峰濃度遠(yuǎn)低于Brown的研究結(jié)果(28.3 μg/mL)。與胡振英等［19］的研究結(jié)果相比，本試驗(yàn)研究表明長(zhǎng)效頭孢噻呋注射液具有較長(zhǎng)的半衰期，較胡振英研究結(jié)果(14.64 h)長(zhǎng)7 h。長(zhǎng)效頭孢噻呋注射液的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道相似［20］。長(zhǎng)效頭孢噻呋注射液的相對(duì)生物利用度為98.41%，說(shuō)明國(guó)產(chǎn)長(zhǎng)效頭孢噻呋注射液與進(jìn)口產(chǎn)品生物利用度相當(dāng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明上海公誼獸藥廠研制的長(zhǎng)效頭孢噻呋注射液峰濃度有所降低，但達(dá)峰時(shí)間和半衰期均延長(zhǎng)，表明具有緩釋作用，能更好的起到動(dòng)物疾病的防治效果。

3.3 肌注速解靈注射液的藥動(dòng)學(xué)特征 通過(guò)對(duì)長(zhǎng)效鹽酸頭孢噻呋注射液和速解靈注射液(輝瑞)藥動(dòng)學(xué)研究，藥動(dòng)參數(shù)經(jīng) t檢驗(yàn)，MRT、Cmax、tmax存在極顯著性差異(P＜0.01)，表明健康豬肌注長(zhǎng)效鹽酸頭孢噻呋注射液(5 mg/kg)與肌注速解靈注射液相比，長(zhǎng)效鹽酸頭孢噻呋注射液?jiǎn)蝿┝考∽⒔o藥吸收較慢，達(dá)峰時(shí)間顯著延遲，達(dá)峰濃度顯著降低，平均駐留時(shí)間顯著延長(zhǎng)，參數(shù)AUC、Kel、t1/2統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，長(zhǎng)效鹽酸頭孢噻呋注射液與肌注速解靈注射液的生物利用度相當(dāng)。

3.4 長(zhǎng)效頭孢噻呋注射液臨床給藥方案的建議健康豬肌注長(zhǎng)效鹽酸頭孢噻呋注射液5 mg/kg后，在 72 h 平均血藥濃度達(dá) 0.88 μg/mL，120 h 達(dá)0.2 μg/mL，144 h仍可檢測(cè)到藥物。肌注速解靈注射液5 mg/kg后，在72 h 平均血藥濃度為0.36 μg/mL，120 h血藥濃度已經(jīng)低于定量限，144 h檢測(cè)不到藥物。結(jié)果表明，健康豬肌注長(zhǎng)效鹽酸頭孢噻呋注射液(5 mg/kg)有效血藥濃度維持時(shí)間更長(zhǎng)，對(duì)臨床敏感菌感染，可用長(zhǎng)效鹽酸頭孢噻呋注射液肌內(nèi)注射，每kg體重5 mg，每2 d給藥1次，連續(xù)給藥2次。

本研究進(jìn)行了國(guó)產(chǎn)頭孢噻呋注射液與進(jìn)口頭孢噻呋注射液的比較藥動(dòng)學(xué)研究，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，國(guó)產(chǎn)藥物與進(jìn)口藥物生物利用度相似。

［1］ 黨曉林，祁長(zhǎng)川，劉紅艷，等.復(fù)方鹽酸頭孢噻呋混懸劑的藥代動(dòng)力學(xué)研究［J］.中國(guó)獸藥雜志，2012，46(2):10 －15.

［2］ 李長(zhǎng)流，俞道進(jìn)，馬玉芳，等.豬血漿中去呋喃甲?；^孢噻呋濃度的HPLC測(cè)定［J］.福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，1(39):58 －62.

［3］ Barere S D，Pille F，Croubels，et al.High － performance liquid chromatographic－UV detection analysis of ceftiofur and its active metabolite desfuroylceftiofur in horse plasma and synovial fluid after regional intravenous perfusion and systemic intravenous injection of ceftiofur sodium［J］.Analytica Chimica Acta，2004，1(512):75－84.

［4］ Brown S A，Hanson B J，Mignot A，et al.Comparison of plasma pharmacokinetics and bioavailability ofceftiofursodium and ceftiofur hydrochloride in pigs after a single intramuscular injection［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，1999，1(22):35－40.

［5］ Berendsen B J，Stolker L A，Nielen M W.Assessment of liquid chromatography－tandem mass spectrometry approaches for the analysis of ceftiofur metabolites in poultry muscle［J］.Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess，2012，29(2):197－207.

［6］ Caraigmill A L，Brown S A，Wetzlich S E，et al.Pharmacokinetics of ceftiofur and metabolites after single intravenous an intramuscular administration and multiple intramuscular adm intration of ceftiofur sodium to sheep［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，1992，1(6):431 －438.

［7］ Cervantes C C，Brown M P，Gronwall R R，et al.Pharmacokinetics concentration of ceftiofur sodium in body fluids and endometrium after repeated intramuscular inmares［J］.Am J Vet Res，1993，54(4):573－575.

［8］ Collard W T，Cox S R，Lesman S P，et al.Pharmacokinetics of ceftiofur crystalline－free acid sterile suspension in the equine［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，2011，34(5):476－481.

［9］ Courtin F，Graigmill A，Wetzlich S E，et al.pharmacokinetics of ceftiofur and metabolites after single intravenous and intramuscular administration and mutiple intramuscular admintration of ceftiofur sodium to dairy goats［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，1997，20(5):368 －373.

［10］ Doré E，Angelos J A，Rowe J D，et al.Pharmacokinetics of ceftiofur crystalline free acid after single subcutaneous administration in lactating and nonlactating domestic goats(Capra aegagrus hircus)［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，2011，34(1):25 －30.

［11］ Dumonceaux G，Isaza R，Koch D E，et al.Pharmacokinetics and im bioavailability ofceftiofurin Asian elephants(Elephas maximus)［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，2005，28(3):441 －446.

［12］ Hall，T L，L A Tell，et al.Pharmacokinetics of ceftiofur sodium and ceftiofur crystalline free acid in neonatal foals［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，2011，34(4):403 －409.

［13］ Liu S，Guo D，Guo Y，et al.Preparation and pharmacokinetics of ceftiofur sodium liposomes in cows［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，2011，34(1):35 －41.

［14］ Meyer J C，Brown M B，Gronwall R R，et al.pharmacokinetics of ceftiofur sodium in neonatal foals after intramuscular injection［J］.Equine Veterinary Journal，1992，24(6):485 － 486.

［15］ Meyer S，Giguère S，Rodriguez R，et al.Pharmacokinetics of intravenous ceftiofur sodium and concentration in body fluids of foals［J］.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics，2009，32(4):309－316.

［16］ Soback S，Ziv G，Winkler M，et al.Pharmacokinetics of ceftiofur administered intravenously and intramuscularly to lactating cows［J］.Israeli Joumal of Rat Ned，1989，1(4):118 －123

［17］ Tantituvanont A，Yimprasert W，Werawatganone P，et al.Pharmacokinetics of ceftiofur hydrochloride in pigs infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus［J］.Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2009，63(2):369 －373.

［18］魏樹禮，張 強(qiáng).生物藥劑學(xué)與藥物動(dòng)力學(xué)［M］.北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2004:16.

［19］胡振英，張新國(guó)，羅永江，等.頭孢噻呋鈉在豬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度研究［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2003，05:14－17.

［20］ Wojick K B，Langan J N，Adkesson M J，et al.Pharmacokinetics of long－acting ceftiofur crystalline－free acid in helmeted guineafowl(Numida meleagris)after a single intramuscular injection［J］.American Journal of Veterinary Research，2011，72(11):1514－1518.