余舒瑩，趙 冰，張霞燕，張曉燕，王艷芳，張麗慧，盧韻碧，魏爾清

(1.浙江大學醫(yī)學院藥理學系，浙江杭州 310058;2.杭州師范大學基礎醫(yī)學部藥理學教研室，浙江杭州 310036)

魚藤酮是一種廣泛應用于農(nóng)業(yè)的殺蟲劑，在體外能損傷多巴胺能神經(jīng)元，產(chǎn)生與帕金森病(Parkinson's disease，PD)病理特征相似的表現(xiàn)。魚藤酮作為一種細胞毒性化合物，是特異性線粒體復合體I抑制劑，可選擇性地阻斷鐵-硫簇N和泛醌Q的作用，導致線粒體呼吸鏈電子轉運障礙，造成氧化應激及ATP生成障礙，從而引起細胞損傷。PC12細胞作為常用的PD細胞模型，是大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤克隆化的細胞株，其合成的酶類、表達的受體以及合成的神經(jīng)遞質接近中腦多巴胺(dopamine，DA)神經(jīng)元，已被廣泛用于 DA神經(jīng)元體外研究，特別是用于PD發(fā)病機制的研究。

花生四烯酸經(jīng)5-脂氧酶催化而生的成半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes，CysLTs)，包括LTC、LTD和LTE，是一類活性很強的炎癥介質，其作用由 CysLT和 CysLT受體介導。CysLTs經(jīng)PD誘變劑魚藤酮處理后，可激活 PC12 細胞 5-脂氧酶，表明 CysLTs可能參與PD病變。魚藤酮還能增加小鼠小膠質細胞株BV2細胞CysLT受體表達，提示CysLT受體參與PD的炎癥調節(jié)過程。本實驗室以往的研究表明，腦缺血性損傷后，腦內(nèi)CysLT表達增加;CysLT受體拮抗劑普魯司特和孟魯司特對腦缺血性損傷有保護作用。但是，DA神經(jīng)元CysLT受體是否也參與PD病變過程，CysLT受體拮抗劑能否保護魚藤酮誘導的神經(jīng)元損傷尚待研究。本研究觀察CysLT受體拮抗劑孟魯司特對魚藤酮引起PC12細胞損傷的作用，以及魚藤酮引起CysLT受體的表達、分布變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 胰酶、多聚賴氨酸、魚藤酮、青霉素、鏈霉素、二苯基四氮唑溴鹽(MTT)購自美國Sigma公司;DMEM高糖培養(yǎng)基和馬血清購自美國Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青生物技術有限公司;兔抗小鼠CysLT受體多克隆抗體由本研究室制備;異硫氰酸熒光素(FITC)標記的山羊抗兔IgG、CY3標記的山羊抗兔IgG購自美國Chemicon公司;孟魯司特(montelukast)由美國Merk公司贈送。BX51熒光顯微鏡購自日本Olympus公司;CO培養(yǎng)箱購自美國Forma Scientific公司;多波長酶標儀(Elx800 Universal Micro-plate Recorder)購自美國 Bio-TEK公司;SDS-PAGE膠電泳轉膜裝置購自美國 BIORAD公司;ODYSSEY免疫印跡膜熒光成像系統(tǒng)購自美國LI-COR Biosciences公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 高分化大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞購自中國科學院上海細胞生物學研究所，用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基(含青霉素10U/L、鏈霉素10μg/L)，在5%CO培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)，2～3 d傳代，相近代數(shù)的細胞用于實驗。當細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底面積80%～90%時，以0.25%胰酶消化3～4 min，將細胞收集到離心管中，1 000 r/min離心5 min后，棄上清。加入培養(yǎng)基重懸細胞，接種在96孔和24孔中的細胞濃度分別為4 ×10/孔、2.5 ×l0/孔。細胞接種24 h后，進行不同處理。

1.3 確定魚藤酮處理損傷濃度及形態(tài)觀察、活性測定(MTT法)PC12細胞種于96孔板，貼壁生長24 h后，分別加入不同濃度魚藤酮(終濃度 0.3、1、3、10、30 μmol/L)，對照組換用培養(yǎng)液，然后放入5%CO培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。在光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并攝影。

為測定細胞活性，處理結束后小心吸棄96孔板每孔的培養(yǎng)液，加入100μL MTT溶液(0.5 mg/ml，DMEM 培養(yǎng)基配制)，在 5%CO培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)孵育2 h后，小心吸棄上清液，每孔加入100μL DMSO中止反應，振搖使生成的formazan顆粒充分溶解，用酶標儀測定波長570 nm處吸光值(OD)，OD值大小反映細胞的存活，以正常對照組MTT吸光值為基數(shù)100%，以藥物處理組與正常對照組吸光值的百分比，計算存活細胞百分率。

1.4 Western blotting測定CysLT受體蛋白用胰酶消化收集魚藤酮處理后的PC12細胞，以常規(guī)方法提取總蛋白，用考馬斯亮藍法做標準曲線，測定提取液中的蛋白濃度。取100 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，先以100 V恒壓使Marker分開，再以150 V恒壓繼續(xù)電泳，直至溴酚藍條帶到達分離膠底部。然后，300 mA電轉移90 min至硝酸纖維素膜，經(jīng)TBST漂洗后，放入含5%脫脂奶粉中，平放在平緩搖動的搖床平臺上，室溫孵育120 min。取出硝酸纖維素膜，放入混有GAPDH(小鼠單克隆抗體1∶5000)及CysLT受體(1∶500)的一抗中，4℃冰箱中過夜，再用TBST漂洗10 min，共3次，與抗兔IRDye700DX?偶聯(lián)或抗鼠IRDye800DX?偶聯(lián)的二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，漂洗后，用凝膠成像系統(tǒng)攝像，利用Quality One軟件以GAPDH為內(nèi)參，結果以CysLT受體和GAPDH的條帶光密度比值相對百分比表示。

1.5 免疫細胞化學檢測細胞CysLT受體的分布 PC12細胞種于24孔板的蓋玻片上，貼壁生長24 h后，細胞經(jīng)不同濃度魚藤酮處理24 h及3 μmol/L魚藤酮處理不同時間后，收集玻片，以0.01 mol/L PBS輕輕漂洗，冰甲醇冰上固定 5 min，再用 0.01 mol/L PBS清洗3次，加5%非免疫羊血清室溫封閉2 h。每孔各加一抗(1∶500)，4℃孵育過夜;次日，PBS清洗3次后，加抗兔FITC標記(綠色)或CY3標記(紅色)的熒光二抗(1∶200)，在室溫下孵育2 h，PBS清洗3次，并用碳酸甘油緩沖液(含1∶1000 DAPI，染細胞核)封片。在熒光顯微鏡下觀察CysLT受體在PC12細胞上的分布并攝影。

2 結果

2.1 魚藤酮誘導PC12細胞損傷變化 魚藤酮(終濃度 0.3、1、3、10、30 μmol/L)處理 PC12細胞24 h后，光鏡下可見，隨著魚藤酮濃度的增大，細胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)學改變，包括細胞突起變短、消失，細胞萎縮、變圓(圖1A);細胞活性明顯降低，分別降低至對照值的91%、81%、76%、76%、75%(P ＜0.05 ～0.01，圖 1B)。魚藤酮3 μmol/L的作用24 h的變化明顯、適度，因此，選擇該條件作為誘導PC12細胞損傷的條件。

2.2 CysLT受體拮抗劑對魚藤酮誘導PC12細胞損傷的影響 常規(guī)培養(yǎng)條件下，孟魯司特0.2、1、5 μmol/L 作用24 h，對細胞活性沒有明顯影響，而 10 μmol/L輕度增高細胞活性［100.0 ±2.3 vs 106.3 ±4.5(%)，P ＜0.01，圖2A］。孟魯司特 0.2 ～10 μmol/L 預先孵育PC12細胞30 min，再用3 μmol/L魚藤酮處理24 h，結果表明1、5 μmol/L 孟魯司特可顯著抑制魚藤酮誘導的細胞活性降低［100.0±2.9 vs 103.7 ± 3.1、98.8 ± 4.3(%)］，而 0.2、10 μmol/L孟魯司特無顯著抑制作用［100.0±2.9 vs 90.9 ± 2.8、77.1 ± 4.5(%)，P ＜ 0.05 ～0.01，圖 2B］。

2.3 魚藤酮引起PC12細胞CysLT受體表達的變化 Western blotting檢測結果表明，PC12細胞在正常條件下表達CysLT受體(條帶約43 kD，圖 3A);魚藤酮 1、3、10 μmol/L 處理 24 h后，PC12細胞表達CysLT受體表達顯著增加［100 ± 4.4 vs 135.7 ± 6.3、146.9 ± 5.8、118.1±5.5(與 GAPDH 的比值)，P ＜0.05，圖 3A］。魚藤酮3 μmol/L 作用3、24 h 后，CysLT受體表達顯著增多［100 ±4.2 vs 155.4 ±5.6，153.3 ±5.7(與 GAPDH 的比值)，P ＜0.05，圖3B］。

2.4 魚藤酮誘導PC12細胞CysLT受體分布的改變 本實驗結果顯示，CysLT受體正常情況下主要分布在細胞核;經(jīng)0.003 μmol/L魚藤酮處理24 h后CysLT受體分布未發(fā)生明顯變化，但 0.01 μmol/L 以上魚藤酮處理 24 h后，CysLT受體趨向分布于胞漿(圖 4A)，當 3 μmol/L魚藤酮處理從25 min開始，CysLT受體分布發(fā)生變化(圖4B)。

3 討論

本研究結果表明，魚藤酮0.3～30 μmol/L處理24 h，可濃度依賴性降低PC12細胞活性，并改變細胞形態(tài)。CysLT受體拮抗劑孟魯司特對魚藤酮誘導損傷的保護作用，提示CysLT受體可能參與PC12細胞的PD樣變化。孟魯司特的作用表現(xiàn)“鐘形”量效關系，即1、5 μmol/L能有效減輕細胞損傷，而 0.2、10 μmol/L 則無明顯減輕作用，這一結果與腦缺血整體動物實驗結果相似。

CysLT受體表達、分布特點進一步證實其與魚藤酮損傷的關系。魚藤酮1～10 μmol/L作用 24 h后，CysLT受體顯著增加，但 30 μmol/L未顯示該作用。鑒于魚藤酮慢性中毒誘導PD病變時能到達腦內(nèi)的濃度可能較低，因此，CysLT受體可能在PD發(fā)生中起調節(jié)作用。魚藤酮3 μmol/L誘導CysLT受體表達的時間過程具有“雙峰”特點，即在3 h及24 h存在表達高峰，提示CysLT受體可能介導急性和后期效應。在大鼠局灶性腦缺血后，缺血中心區(qū)在3～12 h及7～14 d也有2個CysLT受體表達高峰，分別介導急性神經(jīng)元損傷和后期小膠質細胞激活。在本實驗離體條件下，很可能由于魚藤酮誘導早期代謝障礙，促進CysLT受體表達并介導PC12細胞損傷;而后期(24 h)由于細胞因子等釋放促進CysLT受體表達，參與炎癥相關的變化。這一雙峰表達的機制和意義，還有待闡明。

免疫組化結果證實，正常情況下 CysLT受體主要分布于PC12細胞的細胞核內(nèi)，隨魚藤酮作用濃度的升高，CysLT受體移位到胞漿;3 μmol/L魚藤酮作用的時間過程表明，從25 min開始，CysLT受體就發(fā)生明顯的移位。在結腸癌細胞中，CysLT受體也主要分布在核內(nèi)，其意義尚未闡明，但認為與細胞增殖反應有關。在 BV2 細胞，魚藤酮濃度依賴性誘導CysLT受體核移位，可能與小膠質細胞激活相關;但魚藤酮對PC12細胞表現(xiàn)損傷作用，其誘導的CysLT受體移位特點有別于BV2細胞。CysLT受體的這種移位特點，與PC12細胞損傷究竟有什么關聯(lián)，還需要進一步研究。

綜上所述，本研究證明CysLT受體參與魚藤酮誘導的PC12細胞損傷，CysLT受體拮抗劑孟魯司特可減輕魚藤酮誘導的細胞損傷，其機制還有待進一步研究。

［1］OLANOW C W.The pathogenesis of cell death in Parkinson's disease［J］.Mov Disord，2007，22(S17):S335-S342.

［2］SAI Y，WU Q，LE W，et al.Rotenone-induced PC12 cell toxicity is caused by oxidative stress resulting from altered dopamine metabolism ［J］.Toxicol In Vitro，2008，22(6):1461-1468.

［3］GREENAMYRE J T，BETARBET R，SHERER T B.The rotenone model of Parkinson's disease:genes，environment and mitochondria［J］.Parkinsonism Relat Disord，2003，9(S2):S59-S64.

［4］FATO R，BERGAMINI C，BORTOLUS M，et al.Differential effects of mitochondrial complex I inhibitors on production of reactive oxygen species［J］.Biochim Biophys Acta，2009，1787(5):384-392.

［5］ABDIN A A，HAMOUDA H E.Mechanism of the neuroprotective role of coenzyme Q10 with or without L-dopa in rotenone-induced parkinsonism［J］.Neuropharmacology，2008，55(8):1340-1346.

［6］DAS P C，MCELROY W K，COOPER R L.Potential mechanisms responsible for chlorotriazineinduced alterations in catecholamines in pheochromocytoma(PC12)cells［J］.Life Sci，2003，73(24):3123-3138.

［7］SINGH R K，GUPTA S，DASTIDAR S，et al.Cysteinyl leukotrienes and their receptors:molecular and functional characteristics ［J］.Pharmacology，2010，85(6):336-349.

［8］ZHANG Xiao-yan，ZHANG Li-hui，LI Cheng-tan，et al(張曉燕，張麗慧，李成檀，等).5-1ipoxygenase is involved in rotenone induced injury in PC12 cells［J］.Journal of Zhejiang University:Medical Science(浙江大學學報:醫(yī)學版)，2011，40(2):150-155.(in Chinese)

［9］LUO Jiang-yun，ZHANG Zhuang，YU Shu-ying，et al(駱江云，張壯，余舒瑩，等).Rotenone induced changes of cysteinyl leukotriene receptor l expression in BV2 mieroglial cells［J］.Journal of Zhejiang University:Medical Science(浙江大學學報:醫(yī)學版)，201l，40(2):131-138. (in Chinese)

［10］FANG S H，WEI E Q，ZHOU Y，et al.Increased expression of cysteinyl leukotriene receptor-1 in the brain mediates neuronal damage and astrogliosis after focal cerebral ischemia in rats.Neuroscience，2006，140(3):969-979.

［11］ZHANG L H，WEI E Q.ONO-1078 reduces NMDA-induced brain injury and vascular cell adhesion molecule-1 expression in rats［J］.Acta Pharmaco1 Sin，2005，26(4):435-440.

［12］ZHANG W P，WEI E Q，MEI R H，et al.Neuroprotective effect of ONO-1078，a leukotriene receptor antagonist，on focal cerebral ischemia in rats［J］.Acta Pharmacol Sin，2002，23(10):871-877.

［13］YU G L，WEI E Q，WANG M L，et al.Pranlukast，a cysteinyl leukotriene receptor-1 antagonist，protects against chronic ischemic brain injury and inhibits the glial scar formation in mice［J］.Brain Res，2005，1053(1-2):116-125.

［14］YU G L，WEI E Q，ZHANG S H，et al.Montelukast，a cysteinyl leukotriene receptor-1 antagonist，dose-and time-dependently protects focal cerebral ischemia in mice ［J］.Pharmacology，2005，73(1):31-40.

［15］SIDDIQUI M A，KASHYAP M P，KHANNA V K，et al.Association of dopamine DA-D2 receptor inrotenone-induced cytotoxicity in PC12 cells.Toxicol Ind Health，2010，26(8):533-542.

［16］HUANG X J，ZHANG W P，LI C T，et al.Activation of CysLT receptors induces astrocyte proliferation and death after oxygen-glucose deprivation ［J］.Glia，2008，56(1):27-37.

［17］NIELSEN C K，CAMPBELL J I，OHD J F，et al.A novel localization of the G-protein-coupled CysLTreceptor in the nucleus of colorectal adenocarcinoma cells［J］.Cancer Res，2005，65(3):732-742.