付鑫焱，盧蘊容，2，吳娟利，吳雪艷，包愛民

(1.浙江大學醫(yī)學院神經(jīng)生物學系、浙江省神經(jīng)生物學重點實驗室、衛(wèi)生部醫(yī)學神經(jīng)生物學重點實驗室，浙江杭州 310058;2.浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院精神科，浙江杭州 310009)

重性抑郁障礙(Major depressive disorder，MDD)是一種常見的情緒障礙，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，據(jù)統(tǒng)計MDD在浙江省發(fā)病率已達到4.3%。MDD 的主要癥狀是長期情緒低落、思維遲緩和行為遲鈍?；颊吖ぷ髂芰蛐袆恿适?，自殺率高達15%，因此，給個人和社會造成巨大危害。在對MDD的發(fā)病機制研究中發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)元突觸傳遞過程中起信使作用的神經(jīng)遞質(zhì)的改變是重要的致病因素之一。在臨床上，這種改變可以體現(xiàn)為不同腦區(qū)、體液(包括腦脊液、血液和尿液)中神經(jīng)遞質(zhì)水平變化。確定這些神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化特征與發(fā)病、治療以及疾病轉歸之間的關系，無疑對于抑郁癥的臨床診斷和相關發(fā)病機制研究具有重要意義。

氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)是一類能夠通過神經(jīng)突觸傳遞神經(jīng)信息的氨基酸，其中谷氨酸(Glutamate，Glu)和天冬氨酸(Aspartic acid，Asp)是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid，GABA)和甘氨酸(Glycine，Gly)是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。大量的臨床和對于人腦材料的研究證實，氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)參與抑郁癥發(fā)病機制，例如谷氨酸能和GABA能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)調(diào)節(jié)失衡導致下丘腦-垂體-腎上腺軸活性亢進，而后者在抑郁癥癥狀和體征形成中扮演中心角色。關于Asp和Gly在抑郁癥中的改變的研究報道則相對較少，結論也不一致。

Francis等人報道了難治性抑郁癥患者額葉皮層中Asp濃度升高。Altamura等人發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)治療的抑郁癥患者血漿Asp水平和對照組沒有差異，Gly水平顯著降低。Mauri等人發(fā)現(xiàn)，非憂郁型MDD患者血漿Asp和Gly水平與健康對照組相比無顯著差異;用藥物抗抑郁治療8周后，MDD患者血漿Asp和Gly水平與治療前相比也無顯著改變。Sumiyoshi等人同樣報道了MDD患者血漿Gly水平無明顯改變。這些研究發(fā)現(xiàn)之間的差異性可能和樣本的抑郁癥亞型、治療干預方案等因素有關。因此，在進行這類研究中應該特別注意對于抑郁癥亞型、治療干預的措施等條件的限定，以正確判斷氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)水平的相應改變及其和臨床轉歸的關聯(lián)。

研究表明，血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)的存在使血漿和腦中氨基酸絕對水平之間存在差異。BBB的氨基酸轉運體系統(tǒng)能夠將血漿氨基酸轉運至大腦，同時能夠將腦中神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸(包括Asp和Gly)逆濃度梯度轉運至血液。靜脈血和腦脊液內(nèi)氨基酸水平之間存在著相關性。血漿氨基酸水平有可能間接反映腦內(nèi)氨基酸水平而成為MDD的臨床生物學指標之一，但是這種相關性在抑郁癥中是否存在以及特征如何尚待研究。因此，本研究從新發(fā)病MDD抑郁癥亞型患者著手，研究血漿Asp和Gly水平在治療前后的改變。作為對照，還同時研究了血漿內(nèi)非神經(jīng)遞質(zhì)氨基酸天冬酰胺(Asparagine，Asn)的水平。

1 材料與方法

1.1 對象 本實驗研究對象為2009年9月至2010年5月間浙江大學附屬第二醫(yī)院精神科住院及門診的首發(fā)MDD患者。MDD患者由浙江大學附屬第二醫(yī)院精神科?？漆t(yī)師根據(jù)美國《精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第四版》(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，F(xiàn)ourth Edition，DSM-IV)診斷標準診斷，同時進行貝克抑郁問卷(Beck Depression inventory，BDI)和漢密爾頓抑郁量表(Hamilton Depression Rating Scale，HAMD)評分。排除標準為:1)器質(zhì)性精神障礙、精神活性物質(zhì)所致精神障礙、精神分裂癥;2)嚴重性軀體疾病;3)體重指數(shù)(Body Mass Index，BMI)異常 (BMI≤ 18或BMI≥25)。健康對照者來自同期在醫(yī)院進行健康體檢人群，排除任何軀體疾病和精神障礙。15例MDD患者中男性9例、女性6例，平均年齡(47 ±10.7)歲，BECK 評分為(31.3 ±10.3)分，HAMD 評分為(34.0±10.9)分;14位健康對照者中男性7例、女性7例，平均年齡為(49±13.0)歲。其中7例MDD患者(男5例，女2例)在用氟西汀抗抑郁治療2月后進行隨訪并收集血漿，HAMD評分為(14.0±4.2)分。所有患者和健康對照者均志愿加入研究并簽署知情同意書，本研究獲得浙江大學附屬第二醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集和處理 MDD患者和健康對照者分別于上午6∶00-9∶00空腹抽取靜脈血6 ml至抗凝管(含EDTA)中;4℃ 12 000 g離心15 min，取上清液分裝于1.5 ml離心管中，-20℃貯存，并在1個月內(nèi)轉移至-80℃保存。樣品分析時取出樣品，冰上解凍;混勻，靜置20 min，4℃，12 000 g離心 20 min;取上清液至新離心管中，放于真空冷凍干燥儀中凍干，然后用60%乙醇溶解上樣。

1.2.2 氨基酸濃度測定 血漿氨基酸濃度測定采用高效液相色譜—熒光法(High performance liquid chromatography with fluorescence detection，HPLC-FLD)，HPLC 方法參考先前文獻并加以修改。主要儀器與試劑:Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent Technologies)，真空冷凍干燥儀(美國Labconco)。L-Asp、L-Asn、L-Gly標品(美國Sigma公司)，鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde，OPA，美國 Pickering Laboratories公司)，甲醇(霍尼韋爾Burdick＆Jackson公司)，無水醋酸鈉(溫州潤華化工實業(yè)有限公司)等。色譜條件:色譜柱:Venusil XBP-C18柱子(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動相 A 相:醋酸鈉(20 mmol· L)-三乙胺(pH=7.0)-四氫呋喃-甲醇(體積比為1000∶0.18∶3∶100)，流動相 B 相:醋酸鈉(20 mmol· L，pH=7.0)-甲醇(體積比為1∶4)。梯度洗脫程序:在不同時間段，流動相B的體積占流動相總體積(A相 +B相)的百分比分別為:0 ～10 min，90%;10～20 min，88%;20～30 min，50%;30～31 min，90%;31～41 min，90%;整個洗脫過程經(jīng)歷41 min。柱溫:35℃;流速:1.0 ml· min;進樣量 1μL;熒光檢測激發(fā)波長340 nm，發(fā)射波長450 nm。在選定的色譜條件下，經(jīng)過41 min洗脫，Asp、Asn和Gly的色譜峰分離較好(見圖1)。

2 結果

2.1 氨基酸水平 MDD患者血漿Asp水平(2.14±2.02)μmol· L顯著低于健康對照組(8.18 ±3.21)μmol· L，P ＜0.001。在對照組或者MDD組內(nèi)，男性血漿Asp水平和女性相比無顯著差異(P≥0.478)。

MDD患者血漿 Gly水平(98.70±52.64)μmol· L顯著低于健康對照組(143.80±55.14)μmol· L，P=0.033。在對照組內(nèi)或者MDD組內(nèi)，男性血漿Gly水平和女性相比均無顯著性差異(P≥0.722)。

MDD患者血漿 Asn水平(9.02±4.37)μmol· L和健康對照組(11.04 ±4.03)μmol· L相比無顯著差異(P=0.208)。在對照組內(nèi)或者MDD組內(nèi)，男性血漿Asn水平和女性相比也無顯著差異(P≥0.397)。

2.2 相關性分析 在健康對照組，血漿Gly水平與 Asp水平顯著正相關(n=14，r=0.874，P＜0.001，見圖 2A)，Gly水平與 Asn 水平顯著正相關(n=14，r=0.720，P=0.004，見圖 2B)，Asp水平與Asn水平顯著正相關(n=14，r=0.763，P=0.001)。然而，MDD 患者血漿 Gly水平與Asp水平、Asp與Asn水平的相關性分別缺失(P≥0.538)，Gly水平與 Asn水平仍然保持顯著正相關(n=15，r=0.857，P ＜0.001，見圖2C)。

在健康對照和MDD患者中，血漿氨基酸水平與年齡(P≥0.147)無相關性，在新發(fā)MDD患者，血漿氨基酸水平與HAMD評分(P≥0.145)無顯著相關性。

2.3 抗抑郁治療后氨基酸水平 和治療前相比，MDD患者血漿Asp、Gly、Asn水平無顯著改變(P≥0.306)。Gly與 Asp水平、Asp與 Asn水平之間仍然無顯著相關性(P≥0.317)，而Gly水平與Asn水平的顯著正相關性仍然存在(n=7，r=0.980 ，P ＜0.001，見圖2D)。

3 討論

本次研究發(fā)現(xiàn)，新發(fā)MDD患者的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Asp和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)Gly的血漿水平顯著低于健康對照組，非神經(jīng)遞質(zhì)Asn的血漿水平和對照組相比無顯著差異。在健康對照組Gly與Asp水平，以及Asp和Asn水平之間分別顯著正相關，而在MDD患者這些相關性消失。MDD患者抗抑郁治療后在抑郁癥狀顯著改善狀態(tài)下，Asp、Gly和Asn水平無顯著改變，氨基酸水平之間的相關性也保持不變。

我們對于新發(fā)MDD患者興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)Asp的血漿水平顯著降低的報道尚屬首次。Altamura等人曾經(jīng)報道未經(jīng)治療的抑郁癥患者血漿Asp水平和對照組相比沒有差異，我們注意到他們所研究的患者包含雙向抑郁癥患者。有報道雙向抑郁癥患者血漿氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)水平不同于 MDD患者。Mauri等人報道，MDD患者血漿Asp和Gly水平與健康對照組相比無顯著差異，但是他們所研究的患者特指非憂郁型MDD(major depression without melancholia)患者。這與我們所研究的病例也不同，我們的研究囊括了憂郁型和非憂郁型MDD。我們發(fā)現(xiàn)的血漿Gly水平降低和Altamura等人的報道一致，但是 Sumiyoshi等人曾經(jīng)報道MDD患者血漿Gly水平和正常對照組相比無差異。值得注意的是，他們所研究的病例至少有3個月沒有遵醫(yī)囑接受抗抑郁藥物治療，患者平均HAMD評分為23，抑郁程度明顯低于我們目前所研究的新發(fā)病MDD患者(HAMD評分平均值34)。上述這些研究之間的差異提示，在對于抑郁癥患者體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量進行研究時，需要嚴格限定疾病類型、病情程度、治療狀況等干擾因素。MDD患者血漿Asp和Gly水平降低的原因可能包括:(1)MDD患者對營養(yǎng)的消化吸收能力降低，體內(nèi)氨基酸合成功能下降。Asp、Gly和Asn都屬于非必需氨基酸，體內(nèi)能夠自己合成。MDD患者食欲減退，飲食減少，活動量下降，體內(nèi)新陳代謝率降低，因此，Asp、Gly和 Asn的合成可以降低。但是，非神經(jīng)遞質(zhì)氨基酸Asn在血漿中水平保持不變的狀態(tài)則提示，神經(jīng)遞質(zhì)Asp和Gly血漿水平的改變并非單純由外周合成降低引起的。(2)BBB轉運調(diào)節(jié)功能改變。BBB的存在使外周氨基酸不能自由進入中樞，血漿和腦中氨基酸濃度存在著差異。血管內(nèi)皮細胞膜上存在多種氨基酸轉運體系統(tǒng)能夠將血漿中氨基酸轉運至大腦，BBB決定了腦內(nèi)必需氨基酸的獲得和含量。非必需氨基酸例如LAsp的轉運速率和攝入量顯著低于必需氨基酸，但是在慢性疾病條件下，這一從外周到中樞的氨基酸轉運過程則可能扮演重要角色。BBB還參與清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的過程，星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元上存在轉運中性氨基酸和酸性氨基酸的Na依賴的轉運體系統(tǒng)，能夠將腦中神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸，包括Asp和Gly，逆濃度梯度轉運至血液。MDD患者血漿 Asp和 Gly水平降低可能是由于中樞神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸水平降低而導致向外周轉運減少，和/或BBB轉運體功能改變而導致向外周轉運氨基酸水平降低，加上外周氨基酸合成功能減低，共同導致血漿Asp和Gly水平低下。

在健康對照組中，血漿Asp、Gly和Asn水平之間的顯著相關性體現(xiàn)了它們在代謝調(diào)節(jié)通路上的密切關聯(lián)。Asp是合成Asn的前體物質(zhì)，Asn在天冬酰胺酶的催化下又可以轉化為Asp。另一方面，神經(jīng)遞質(zhì)Asp和Gly都是N-甲 基-D-天 冬 氨 酸 (N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體的天然配體，Asp是其內(nèi)源性激動劑，Gly是其必需的協(xié)同激動劑，Asp 和Gly之間動態(tài)平衡的調(diào)節(jié)機制是生理狀態(tài)下NMDA受體功能維持正常的保證。在MDD患者中這些調(diào)節(jié)機制紊亂，可能是造成這些神經(jīng)遞質(zhì)之間相關性喪失的主要原因。MDD患者Gly水平與Asn水平之間的顯著正相關性在治療前后均未發(fā)生改變，這其中的生物學意義值得進一步研究。這種存在于MDD的神經(jīng)遞質(zhì)和非神經(jīng)遞質(zhì)類氨基酸之間的密切關聯(lián)，為我們了解MDD中NMDA受體調(diào)節(jié)狀態(tài)提供了有益的線索。此外，外周非神經(jīng)組織，例如骨骼、胰腺、心臟、肺臟、肝臟、腸道等處也發(fā)現(xiàn)存在著谷氨酸受體，人們推測谷氨酸可能類似于分布更為廣泛的“細胞因子”，對不同組織的細胞功能產(chǎn)生影響。因此，抑郁癥患者血漿氨基酸水平的改變也為其外周臟器功能改變提供了一種可能的原因，其具體作用機制和結果有待進一步研究。

本次研究發(fā)現(xiàn)，MDD患者血漿Asp和Gly及Asn水平在抗抑郁治療前后無顯著變化，這與前人采用藥物治療MDD患者的觀察報道一致。值得注意的是，Palmio 等人發(fā)現(xiàn)電休克療法(Electroconvulsive therapy，ECT)對Gly水平無顯著影響，但是引起MDD患者血漿Asp和Asn水平顯著升高。有報道稱ECT能夠顯著改變BBB的通透性。這再次顯示不同的治療方案可以顯著影響體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)轉運過程。因此，在進行對比研究時要仔細匹配相關干擾因素，在分析結論時要對相關干擾因素加以甄別。由于在氟西汀抗抑郁治療之后，在抑郁癥狀改善的條件下，MDD患者Asp和Gly及Asn水平?jīng)]有顯著改變，而氨基酸水平之間的相關性也保持不變。有理由推測這提示了血漿Asp和Gly低水平狀態(tài)可能是MDD的特征性而不是階段性生物學指標，應該在擁有更大規(guī)模臨床樣本量的條件下對此加以確認，并進一步和其他抑郁癥亞型進行對比。

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