孫 博，高尚鋒，阮玲娟，包愛民

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系、浙江省神經(jīng)生物學(xué)重點實驗室、衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)重點實驗室，浙江杭州 310058)

下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamo-pituitary-adrenal axis，HPA)軸是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要組成部分，參與調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)。下丘腦室旁核(paraventricularnucleus，PVN)分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)作用于垂體，垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)作用于腎上腺皮質(zhì)，腎上腺皮質(zhì)分泌的糖皮質(zhì)激素(大鼠中為皮質(zhì)酮)介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)。此外，腎上腺皮質(zhì)激素還可以作用于大腦前額葉皮層、海馬、下丘腦等部位，對HPA軸進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)。HPA軸活性亢進(jìn)，尤其是其活性的中樞性驅(qū)動因子CRH神經(jīng)元的過度激活，是抑郁癥發(fā)病機制中的關(guān)鍵因素。我們的前期研究表明，人體下丘腦PVN內(nèi)CRH神經(jīng)元活性存在著明顯性別差異，并且與外周性激素水平相關(guān)，這一生理現(xiàn)象可能是抑郁癥發(fā)病中性別差異的基礎(chǔ)。

性激素是甾體激素，可以直接進(jìn)入細(xì)胞通過與其核受體結(jié)合調(diào)節(jié)目的基因轉(zhuǎn)錄。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，雄激素(核)受體(androgen receptor，AR)和雌激素(核)受體(estrogen receptor，ER)及下丘腦PVN內(nèi)CRH神經(jīng)元均分別存在著共定位，雄激素與AR結(jié)合后可以抑制CRH基因表達(dá)，減低HPA軸活性;雌激素和ER結(jié)合后可刺激CRH基因表達(dá)，提高HPA軸活性。抑郁癥患者下丘腦PVN內(nèi)CRH神經(jīng)元活性增高伴隨ER基因表達(dá)上調(diào)和AR基因表達(dá)下調(diào)。這些研究提示，性激素及其受體在抑郁癥中直接參與HPA軸活性的調(diào)節(jié)。

早期生活壓力(又稱童年逆境)，例如兒童期遭受虐待、忽視等，可能造成HPA軸活性的持續(xù)性改變，增加其成年期應(yīng)激敏感性以及罹患抑郁癥的易感性。然而，這種影響存在著性別差異。經(jīng)歷過早期生活壓力的女性成年后罹患抑郁癥的風(fēng)險更大。大鼠母愛剝奪模型通過將剛出生的仔鼠與母鼠短暫隔離，模擬由于母愛缺乏造成的早期生活壓力，是研究這一類疾病的良好動物模型。已有報道顯示，雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠在母愛剝奪后HPA軸活性升高。但是，迄今為止尚缺乏對于雌性SD大鼠母愛剝奪模型的研究的報道。由于抑郁癥的發(fā)病和早期生活壓力均與HPA軸活性密切相關(guān)，并都存在性別差異，而臨床上女性重型抑郁障礙的發(fā)病率是男性的兩倍，因此，研究雌性大鼠母愛剝奪模型的特征具有重要意義。在本研究中我們建立雌性大鼠母愛剝奪模型，探討母愛剝奪的雌鼠在成年期HPA軸活性和應(yīng)激反應(yīng)特征。

1 材料與方法

1.1 母愛剝奪模型建立 母鼠選擇正常成年SD大鼠(清潔級)，體重220～250 g。根據(jù)已報道的雄鼠實驗?zāi)Ｐ驮炷?母鼠生產(chǎn)仔鼠的當(dāng)日定義為P0，仔鼠出生后選擇雌性仔鼠進(jìn)行研究。出生后第1天(P1)將出生自同一孕鼠的雌性仔鼠隨機分為母愛剝奪組(n=24)和對照組(n=26)。對于母愛剝奪組，出生后第2～5天(P2—P5)，每日將仔鼠與母鼠分離4 h，第6～20天(P6—P20)，每日分離6 h。對照組仔鼠和母鼠始終共同生活，不做任何特殊處理。第21天，實驗組和對照組仔鼠同時斷奶，移入標(biāo)準(zhǔn)的實驗動物恒溫恒濕飼養(yǎng)環(huán)境，自由飲食，日夜循環(huán)為12 h/12 h。

1.2 急性應(yīng)激 在雌鼠成年后(P100)，通過每日上午9∶00-10∶00陰道涂片，連續(xù)觀察兩個完整動情周期。分別選擇處于動情前期和動情期的雌鼠進(jìn)行直接取材或急性應(yīng)激后取材。急性應(yīng)激為輕微足底電擊，使用0.8 mA電流每間隔25 s給予5 s電擊，連續(xù)進(jìn)行30個循環(huán)，共計15 min。在兩個動情周期的階段(動情前期、動情期)分別建立4組:母愛剝奪急性應(yīng)激組、母愛剝奪非急性應(yīng)激組、非母愛剝奪急性應(yīng)激組和非母愛剝奪非急性應(yīng)激組，每組6～7只大鼠。

1.3 取材 于上午9∶00-11∶00完成對非急性應(yīng)激組取材之后再完成對急性應(yīng)激組的足底電擊。電擊結(jié)束后立即斷頭。使用EDTA抗凝管留取軀干血，溫和混勻后，4℃條件下1500 r/min離心20 min，取上層血漿，分裝后保存于-80℃冰箱。于冰上快速取出整腦，并置于4%多聚甲醛溶液中4℃固定24 h，之后在20%和30%蔗糖溶液中分別脫水24 h，最終保存在4℃的30%蔗糖溶液中。所有標(biāo)本保存到相關(guān)檢測開始時取出。

1.4 激素水平測定 采用放射免疫法測定血漿雌二醇(DSL公司)、睪酮(Immotech公司)、ACTH(Cisbio公司)水平。雌二醇的組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為8.9%和12.2%，睪酮的組內(nèi)和組間變異系數(shù)為8.6%和11.9%，ACTH組內(nèi)和組間的變異系數(shù)分別為10.2%和2.2%。采用酶聯(lián)免疫吸附法測定血漿皮質(zhì)酮(IBL公司)水平，組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為4.0%和 6.2%。

1.5 PVN內(nèi)ER-β和AR免疫組化染色 使用冰凍切片常規(guī)免疫組織化學(xué)方法檢測下丘腦PVN中ER-β和AR的表達(dá)。AR抗體來自BD公司(1∶400稀釋)，ER-β抗體來自 Abcam公司(1∶200稀釋)，均為4℃孵育過夜，兩種抗體均為兔來源的多克隆抗體。二抗為山羊抗兔血清(中彬金橋公司，不稀釋直接使用，室溫1 h)，顯色劑為 DAB(Sigma公司)。步驟中，所有除特殊標(biāo)注外，稀釋液和洗滌液均為Tris-HCl緩沖液(TBS 溶液，0.05 mol/L，pH=7.6)。使用 Image Pro Plus 6.2(Media Cybernetics，Bethesda，USA)軟件進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)圖像分析。計數(shù)細(xì)胞時，在高倍鏡下(40倍物鏡)隨機選取下丘腦PVN內(nèi)5個100 μm×100 μm的視野，對每個視野中陽性染色細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，平均后作為計數(shù)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 正常成年雌鼠血漿性激素水平 未經(jīng)過母愛剝奪和足底電擊的成年雌鼠在不同動情周期血漿性激素水平的變化如圖1顯示。與動情前期相比，血漿中雌二醇(A)和睪酮(B)水平在動情期和動情間期都顯著下降(P＜0.001)，但二者在動情期和動情間期之間均沒有顯著差異。

2.2 血漿ACTH水平 正常對照組成年雌性大鼠血漿ACTH水平在動情前期和動情期之間沒有明顯差異。母愛剝奪導(dǎo)致血漿中基礎(chǔ)ACTH水平明顯下降 (圖2A，P=0.012)，但對足底電擊引起的ACTH水平變化無顯著影響。母愛剝奪引起的ACTH降低主要出現(xiàn)在動情前期(圖2B，P=0.047)而不是動情期。足底電擊在母愛剝奪和非剝奪雌鼠中均引起血漿中ACTH濃度顯著升高(圖2，P ＜0.0001)，這種應(yīng)激反應(yīng)與大鼠的動情周期無關(guān)。

2.3 血漿皮質(zhì)酮水平 正常對照組成年雌性大鼠血漿皮質(zhì)酮水平在動情前期和動情期之間沒有明顯差異。母愛剝奪引起的皮質(zhì)酮水平在動情前期和動情期均有降低的趨勢。足底電擊在母愛剝奪和非剝奪雌鼠中均引起血漿中皮質(zhì)酮濃度顯著升高(圖3，P＜0.05)，動情前期對照組和母愛剝奪組雌鼠都比動情期雌鼠對足底電擊更為敏感(圖3B、C，P ＜0.01)。母愛剝奪導(dǎo)致血漿中基礎(chǔ)皮質(zhì)酮水平明顯下降 (圖3A，P=0.019)，但對足底電擊引起的皮質(zhì)酮水平變化無顯著影響。

2.4 下丘腦PVN內(nèi)AR和ER表達(dá) AR和ER-β廣泛分布與下丘腦區(qū)域，但在PVN中的染色輪廓明顯(圖4A、B)。AR主要表達(dá)在細(xì)胞核(圖4a)，ER-β在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有染色(圖4b)。母愛剝奪顯著降低成年雌鼠下丘腦 PVN中 AR陽性細(xì)胞數(shù)(圖 5，P=0.008)，這種影響主要表現(xiàn)在動情期。急性足底電擊沒有導(dǎo)致母愛剝奪鼠和非剝奪鼠下丘腦PVN中AR表達(dá)的改變。母愛剝奪和/或足底應(yīng)激對下丘腦PVN中ER-β陽性細(xì)胞數(shù)均無顯著影響。

3 討論

本次研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歷母愛剝奪的雌性SD大鼠成年后血漿基礎(chǔ)ACTH和皮質(zhì)酮水平明顯下降。母愛剝奪引起的血漿ACTH基礎(chǔ)水平降低主要表現(xiàn)在動情前期，而皮質(zhì)酮水平的降低同時表現(xiàn)在動情前期和動情期。急性應(yīng)激(足底電擊)在母愛剝奪和非剝奪雌性SD大鼠中均引起血漿中ACTH和皮質(zhì)酮濃度顯著升高。這與前人應(yīng)用其它急性應(yīng)激模型得到的結(jié)果相符，同時也說明成年后的急性應(yīng)激并不能使母愛剝奪雌鼠的HPA軸活性敏化。下丘腦PVN內(nèi)ER-β陽性細(xì)胞數(shù)在雌鼠母愛剝奪和急性應(yīng)激后無顯著改變，但是AR陽性細(xì)胞數(shù)在母愛剝奪后顯著降低。這說明AR表達(dá)明顯受到母愛剝奪的影響，并參與調(diào)節(jié)HPA軸活性。

成年健康雌性SD大鼠在動情周期的不同階段血漿性激素水平存在明顯波動，從動情前期向動情期過渡中雌二醇和睪酮水平均顯著降低，而在動情期和動情間期之間這些激素水平波動并不顯著。因此，我們選擇連續(xù)的兩個階段(動情前期和動情期)，對經(jīng)受過早期母愛剝奪的雌鼠進(jìn)行HPA軸活性及其在急性應(yīng)激反應(yīng)中的變化的研究。在動情前期血漿中性激素的水平最高，因此，動情前期ACTH的水平改變提示其更依賴于性激素對于HPA軸功能的調(diào)節(jié)。在血漿性激素高水平的動情前期和血漿性激素水平下降的動情期，皮質(zhì)酮水平均發(fā)生改變，提示皮質(zhì)酮水平受到性激素之外的其它因素的調(diào)節(jié)。

Nemeroff等在使用雄性SD大鼠進(jìn)行母愛剝奪實驗時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歷母愛剝奪的雄鼠成年后HPA軸基礎(chǔ)活性上升，表現(xiàn)為下丘腦正中隆起處CRH濃度增加和血清ACTH水平升高。在本實驗中，經(jīng)歷相同母愛剝奪過程的SD雌鼠的HPA軸基礎(chǔ)活性降低，表現(xiàn)為血漿ACTH和皮質(zhì)酮水平下降。這提示母愛剝奪模型的HPA軸活性存在著性別差異。在其他母愛剝奪模型和其他品系的大鼠中，也存在類似的性別差異。例如在Long-Evans大鼠中，母愛剝奪只對雌鼠造成影響，而在單次長時間母愛剝奪模型中，雄性Wistar大鼠的抑郁樣反應(yīng)的易感性更高。這種性別差異提示，在進(jìn)行對于動物母愛剝奪效應(yīng)的研究中，要注意甄別動物品系和性別差異，所得出的研究結(jié)論要注意限定動物品系和性別范疇。

SD雌性大鼠母愛剝奪后的HPA軸活性“降低”也提示該模型中的母愛剝奪很有可能引發(fā)了雌鼠的類似創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(Posttraumatic Stress Disorder，PTSD)反 應(yīng)。PTSD是人類的早期生活壓力或生活中創(chuàng)傷性經(jīng)歷造成的精神疾病之一。PTSD的典型表現(xiàn)之一就是HPA軸活性減低，這與本研究的研究結(jié)果相符。PTSD患者海馬功能紊亂，糖皮質(zhì)激素受體和鹽皮質(zhì)激素受體的敏感性增強，使得HPA軸負(fù)反饋增強，最終使患者基礎(chǔ)HPA 軸活性減低。

本研究發(fā)現(xiàn)母愛剝奪引起雌性SD大鼠下丘腦PVN內(nèi)AR表達(dá)下調(diào)，而AR對CRH神經(jīng)元活性具有直接抑制作用，因此，這種“去抑制”狀態(tài)引起的HPA軸活性“增加”，可能表現(xiàn)于PVN內(nèi)向腦干自主神經(jīng)系統(tǒng)投射而不是經(jīng)典地向垂體分泌的CRH增加。向腦干自主神經(jīng)系統(tǒng)投射的CRH的效應(yīng)是通過該系統(tǒng)增加腎上腺皮質(zhì)對于ACTH的敏感性而產(chǎn)生的。這符合本研究所發(fā)現(xiàn)的SD雌性大鼠母愛剝奪模型具有類似于PTSD患者的皮質(zhì)激素受體敏感性增強，HPA軸負(fù)反饋增強而最終導(dǎo)致ACTH、皮質(zhì)酮等基礎(chǔ)水平減低現(xiàn)象。因此，可以推測母愛剝奪可能至少通過兩條通路影響神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng):一條通過下調(diào)PVN中AR的表達(dá)而“增加”HPA軸基礎(chǔ)活性;另一條通過增加糖皮質(zhì)激素受體的敏感性而“減低”HPA軸基礎(chǔ)活性，其最終結(jié)果都是導(dǎo)致動物在成年后HPA軸基礎(chǔ)活性和應(yīng)激反應(yīng)的易感性改變。值得注意的是，這兩條通路調(diào)節(jié)的最終結(jié)果可能具有動物品系差異和性別差異，研究時需要進(jìn)行甄別。

本研究建立的雌性SD大鼠母愛剝奪模型，為研究生活早期不良應(yīng)激對成年后應(yīng)激反應(yīng)和/或抑郁癥等疾病的易感性及其性別差異機制提供了有益的研究工具。母愛剝奪可以使雌性SD大鼠HPA軸基礎(chǔ)活性降低，該變化與外周性激素水平波動相關(guān)聯(lián)。下丘腦內(nèi)雄激素比雌激素對于CRH活性的調(diào)節(jié)作用可能更為顯著。

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