唐于荔 王文敏 俞志鵬

特發(fā)性全面性癲癇 （idiopathic generalized epilepsies，IGE）約占癲癇患者的 20% ～ 30%［1］多無明確發(fā)病原因，神經(jīng)影像學(xué)檢查腦部無明顯的器質(zhì)性改變，有一定年齡依從性、以兒童和青少年多見的一類全面性發(fā)作的癲癇。多年來，研究者進(jìn)行癲癇發(fā)病機(jī)制的探討，發(fā)現(xiàn)遺傳因素在特發(fā)性癲癇中具有重要影響，編碼離子通道的基因突變是造成離子通道異常的原因［2］。目前鈉、鉀、鈣、氯離子通道與IGE相關(guān)性研究較為明確［3］。自Haug.K等［4］發(fā)現(xiàn)了涉及原發(fā)性全面性癲癇綜合征亞型的CLCN2基因突變后，人們不斷對此區(qū)域進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了幾十種單核苷酸多態(tài)性［5-7］。2007年梁麗君等［8］首次對云南少數(shù)民族（基諾族）和漢族特發(fā)性全面強(qiáng)直-陣攣性癲癇與CLCN2基因相關(guān)性進(jìn)行研究。此次我們增加樣本量，應(yīng)用病例-對照方法首次研究云南省5個(gè)獨(dú)有少數(shù)民族（基諾族、阿昌族、布朗族、佤族、拉祜族）IGE與CLCN2基因中3個(gè)SNP 位點(diǎn) rs2228291、rs6770808、rs6773786 之間 相關(guān)性，旨在為特發(fā)性全面性癲癇病因?qū)W提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象與分組 本研究中入選IGE患者的診斷主要根據(jù)1989年國際抗癲癇聯(lián)盟（IEAE）分類及命名委員會(huì)提出的癲癇及癲癇綜合征分類診斷標(biāo)準(zhǔn)確定發(fā)作類型，參閱流行病學(xué)病例確定標(biāo)準(zhǔn)及WHO在中國使用的癲癇調(diào)查問卷，入組標(biāo)準(zhǔn)為：①準(zhǔn)確的病史和特征：患者有2次以上典型癲癇發(fā)作病史，可表現(xiàn)為全面性強(qiáng)直-陣攣性發(fā)作、兒童失神性癲癇、青少年肌陣攣性癲癇、青少年失神性癲癇等；②智力正常及除癇性發(fā)作外無其他神經(jīng)病學(xué)體質(zhì)；③抗癲癇藥物有效。排除標(biāo)準(zhǔn)為：①僅有熱性驚厥或新生兒抽搐不診斷為癲癇；②已明確由于腦部疾病急性期誘發(fā)引起的癇性發(fā)作不納入研究對象［9－10］。少數(shù)民族對照組為無癲癇病史的云南健康人群。

具體分組為：①少數(shù)民族病例組：包括上述5個(gè)少數(shù)民族共92例?；Z族患者為2005年10月至12月在云南省西雙版納傣族自治州入戶收集，阿昌族患者于2008年1月在德宏傣族景頗族自治州入戶收集，布朗族、佤族、拉祜族于2007年6月在臨滄地區(qū)入戶收集。②少數(shù)民族對照組：共170例，為同期收集的上述5個(gè)少數(shù)民族IGE患者的一級親屬。

1.2 方法 ①血樣采集及預(yù)處理：采集每位研究對象外周靜脈血2 mL放于EDTA抗凝管中，并加入等體積DNA保存液，－80℃低溫保存待用。②DNA提取：采用苯酚－氯仿法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA。③PCR反應(yīng)：根據(jù)本實(shí)驗(yàn)3個(gè)CLCN2多態(tài)性位點(diǎn)信息（見表1）設(shè)計(jì)引物。PCR反應(yīng)總體積為20 μL，含基因組 DNA 1.5 μL，10X PCR Buffer（Mg2＋Free）2 μL，MgC12（12.5 mM）1.5 μL，Mixture（各 1.25 mM）1.5 μL，引物 1（up）（10 μM）0.1 μL，引物2 （down）（10 μM）0.1μL，rTaq DNA 聚合酶0.2 μL。 反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性 2 min，94 ℃變性20 s，Tm 退火 25 s，72℃ 延伸 30 s，35 次循環(huán)后 72℃延伸10min。④單堿基延伸（SNapshot）反應(yīng)及測序測序膠圖經(jīng)Applied Biosystem自帶的Sequencing Analysis 5.2分析軟件分析后轉(zhuǎn)化為測序結(jié)果，測序結(jié)果再用SeqMan軟件進(jìn)行經(jīng)手工校正無錯(cuò)讀的序列成為原始數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)錄入SPSS 17.0軟件數(shù)據(jù)庫并對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組間進(jìn)行遺傳平衡適合性檢驗(yàn)，等位基因頻率（allele frequency）及基因型頻率（genotype frequency）的比較均采用卡方檢驗(yàn) χ2，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α ＝ 0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 少數(shù)民族病例組共92例，男57例，女35例。少數(shù)民族對照組共170例，男84例，女86例。

2.2 遺傳平衡檢驗(yàn) CLCN2基因SNP位點(diǎn)rs2228291、rs6770808在少數(shù)民族病例組及對照組處于 Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P ＞ 0.05），位點(diǎn)rs6773786在少數(shù)民族病例組及對照組不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P ＜ 0.05）。

2.3 病例－對照研究結(jié)果 3個(gè)SNP位點(diǎn)在少數(shù)民族病例組與對照組間基因型頻率獨(dú)立性檢驗(yàn)：rs2228291、rs6770808、rs6773786 各位 點(diǎn)基因 型頻率在少數(shù)民族病例組與對照組間比較均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）（見表 2）。

3個(gè)SNP位點(diǎn)在少數(shù)民族病例組與對照組間等位基因頻率檢驗(yàn)：rs2228291、rs6770808、rs6773786各位點(diǎn)基因型頻率在少數(shù)民族病例組與對照組間比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）（見表3）。

3 討論

癲癇是一種常見的腦部疾病，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中僅次于腦血管病變，頻繁發(fā)作可引起記憶、學(xué)習(xí)、行為等全面而廣泛的認(rèn)知功能障礙，致傷、致殘甚至危及生命，嚴(yán)重影響患者健康和生存質(zhì)量。由于特發(fā)性癲癇的致病原因不明，探討其發(fā)病機(jī)制對疾病的診斷、治療、預(yù)防顯得至關(guān)重要。自從Haug.K在特發(fā)性癲癇家系中發(fā)現(xiàn)了3種相關(guān)氯通道基因突變［4］，人們認(rèn)識到電壓門控氯通道CLC?2與原發(fā)性癲癇關(guān)系密切，CLC?2通道缺陷可致癲癇發(fā)作。

表1 CLCN2基因中3個(gè)SNP位點(diǎn)PCR擴(kuò)增片段與引物序列相關(guān)信息

表2 少數(shù)民族病例組與對照組間CLCN2基因SNP位點(diǎn)基因型頻率

表3 少數(shù)民族病例組與對照組間CLCN2基因SNP位點(diǎn)等位基因頻率

國外學(xué)者對CLCN2基因突變與IGE的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行廣泛研究，發(fā)現(xiàn)了CLCN2基因的數(shù)十種SNP改變，但研究結(jié)論不同。SNP（single nucleotide polymophism），即單核苷酸多態(tài)，是一種高效便捷的分子標(biāo)記，更能反映個(gè)體特異性的特點(diǎn)。SNaP shot方法也稱小測序，通常用于10～30個(gè)SNP位點(diǎn)分析，主要針對中等通量的SNP分型項(xiàng)目。

云南省是我國少數(shù)民族最多的省份，其豐富的少數(shù)民族資源、族內(nèi)通婚習(xí)俗、居住相對集中、長期處于隔離或相對隔離狀態(tài)、受外界影響相對較小等特點(diǎn)均有利于進(jìn)行疾病的遺傳學(xué)研究。本實(shí)驗(yàn)采用SNaP shot方法檢測CLCN2基因多態(tài)性位點(diǎn) rs2228291、rs6770808、rs6773786 是否與云南少數(shù)民族特發(fā)性全面性癲癇相關(guān)。

一般資料統(tǒng)計(jì)再次證實(shí)云南省5種少數(shù)民族IGEs發(fā)病年齡仍多在20歲之前，與目前流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)論相似［10-11］。本次研究rs2228291、rs6770808位點(diǎn)無論在少數(shù)民族病例組還是對照組均處于遺傳平衡狀態(tài)，說明樣本代表性較好，符合遺傳平衡狀態(tài)。而rs6773786位點(diǎn)在少數(shù)民族病例組及對照組不符合Hardy?weinberg遺傳平衡定理。分析其原因可能是：采樣不是隨機(jī)進(jìn)行或和原發(fā)性全面性癲癇疾病相關(guān)。維持群體的遺傳平衡需要一定的條件，或者說這種遺傳平衡受一些因素的影響，例如群體要很大，必須是隨機(jī)交配而非選擇交配，不會(huì)因遷移而產(chǎn)生群體結(jié)構(gòu)的變化等。CLCN2基因多態(tài)性位點(diǎn) rs2228291、rs6770808、rs6773786 檢測中云南少數(shù)民族病例組與對照組基因型頻率、等位基因頻率比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說明上述3個(gè)CLCN2基因多態(tài)性位點(diǎn)與云南5種少數(shù)民族—基諾族、阿昌族、布朗族、佤族、拉祜族人群IGE可能無顯著相關(guān)性。

本實(shí)驗(yàn)與既往研究有相似之處，也有不同，推測造成的原因可能是：①本實(shí)驗(yàn)研究對象針對云南五種少數(shù)民族IGE患者及其對照人群，可能存在種族差異性；②因各民族樣本量少而合并成少數(shù)民族病例組可能對實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析有一定影響；③本實(shí)驗(yàn)針對特發(fā)性全面性癲癇，且患者多表現(xiàn)為特發(fā)性全面強(qiáng)直-陣攣性癲癇，臨床表型相對單一，可能致使研究結(jié)論的不同；④上述三個(gè)SNP位點(diǎn)位于CLCN2基因不同區(qū)域，而且每個(gè)基因SNP位點(diǎn)的作用有限，存在多個(gè)基因共同作用的可能，在重復(fù)性研究中可能會(huì)出現(xiàn)與既往研究報(bào)道不符的情況。

本研究探討了云南少數(shù)民族人群IGE的可能發(fā)病機(jī)制，在后續(xù)研究中有必要擴(kuò)大少數(shù)民族樣本數(shù)量及癲癇發(fā)作類型進(jìn)行SNP位點(diǎn)的功能研究、檢測大樣本全基因序列、多位點(diǎn)構(gòu)成的單體型分析、異常蛋白質(zhì)產(chǎn)物功能檢測等工作，以早日闡明癲癇發(fā)病機(jī)制與遺傳因素的關(guān)系，特別是IGE與基因突變之間的聯(lián)系，在臨床上對特發(fā)性癲癇的基因診斷及轉(zhuǎn)基因治療提供依據(jù)。

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