王燕飛 夏海琴

高血壓對大、小血管的危害可能有普遍作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)高血壓與體內(nèi)某些酶的基因多態(tài)性有關(guān)［2］。已有研究表明PON155 M等位基因是高血壓的危險因素，而高血壓是動脈粥樣硬化性腦梗死的獨立危險因素。高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein，HDL）有對抗動脈粥樣硬化（artherosc lerosis，AS）的性質(zhì)，人類血漿對氧磷酶（paraoxonase，PON）與HDL相連接，能阻止低密度脂蛋白膽固醇脂質(zhì)過氧化物的形成。研究表明PON相關(guān)基因（PON1、PON2）與動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生相關(guān)［3］。其中PON1基因目前常見的兩種基因多態(tài)性，PON-1基因多態(tài)性與酶活性密切相關(guān)，在一定程度上決定了其抗氧化能力，與動脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)。在對氧磷酶1基因編碼區(qū)還存在兩種常見的基因多態(tài)性，分別是CGA／CAA置換導(dǎo)致 192位 Arg／Gln多態(tài)性（Q192R）和 ATG／TTG 顛換導(dǎo)致 55 位 Met／Len多態(tài)性（L55M）。我們應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技術(shù)研究PON1基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死合并高血壓的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇山西漢族腦梗死患者和健康人為研究對象。

1.1.1 實驗組 2009年3月份至2010年3月到我院神經(jīng)內(nèi)科住院的105例腦梗死患者，并經(jīng)頭部CT和／或MRI證實。納入標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)病到入院72 h內(nèi)的患者；②符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］；③初次發(fā)病患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重心、肝、肺、腎功能不全患者；②有心房纖顫患者；③近期有外科手術(shù)或外傷史；④血液病、自身免疫性疾病、妊娠；⑤半年內(nèi)曾有降脂治療者；入院72 h內(nèi)行頸動脈彩超檢查，篩查有頸動脈斑塊形成。

1.1.2 正常對照組 同期在我院健康體檢者 100例，均經(jīng)過臨床檢查和／或影像學(xué)檢查排除腦血管病，無腦血管病家族史。記錄以上研究對象的年齡、性別等指標(biāo)，測量身高、體重、腰圍、臀圍、血壓、血脂、空腹血糖、糖化血紅蛋白等臨床生物化學(xué)指標(biāo)，計算體質(zhì)指數(shù)和腰臀比。入選者均簽署知情同意書。

1.2 方法 血脂水平的測定：受試者空腹12 h以上，平臥30 min后取肘靜脈血。血脂測定：總膽同醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL?C）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL?C）均采用全自動生化分析儀測定。DNA提?。嚎崭轨o脈血以EDTA抗凝.采用NaI提取法從白細(xì)胞中提取基因組DNA。（3）PON1編碼區(qū)L55M基因型分析：PCR擴(kuò)增相應(yīng)的目的片段，長度為144 bp，引物1：GAGTGAT GTATAGCCCCAGTTTC nt，引物 2：AG TCCATTAG GCAGTATCTCCgnt，PCR緩沖液含300 mmol／L Tris?HCl，75 mmol／L硫酸銨，5 mmol／L MgCl2，pH10.0。PCR循環(huán)：94℃預(yù)變性5 min，94℃ 變性1 min，65℃退火 45 s，72℃延伸 45 s；循環(huán) 40次，72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用HinfⅠ酶切，3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因型（圖1）。PON1編碼區(qū)Q192R基因型分析：PCR擴(kuò)增相應(yīng)的目的片段，長度為111 bp，引物 1：TTGAATGATATTGTTGCTGTGGGA CCTGAGnt.，引物 2：CGACCACGCTAAAC CCAAAT ACATCTCCCAGaA nt，PCR 緩沖液含 300 mmol／L Tris?HCl，75 mmol／L硫酸銨，5 mmol／L MgCl2，pH 10.0。PCR循環(huán)：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，65℃退火 45 s，72℃延伸 45 s；循環(huán) 40次，72℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用HinfⅠ酶切，3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因型（圖2）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS15.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有計量數(shù)據(jù)均以（）表示，兩組間比較采用t檢驗。多組間比較采用方差分析，兩組間基因型及等位基因計數(shù)資料用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般特征 兩組年齡、性別、吸煙、體重?zé)o顯著性差異；收縮壓、舒張壓、總膽固醇、總甘油三酯及LDL與對照組比較，差異有意義（P＜0.05）。

2.2 PON基因型及等位基因頻率的分布 從表1可以看出，PON1192的基因型、等位基因頻率分布在對照組和腦梗死組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而PON1 L55M的基因型分布兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，腦梗死的M等位基因頻率明顯高于對照組（P＜0.05）。

圖2 PON1 Q192R位點酶切電泳圖

圖1 PON1 L55M位點酶切電泳圖

2.3 腦梗死合并高血壓患者的PON基因型及等位基因頻率分布 表2結(jié)果表明PON1 Q192 R基因型及等位基因頻率分布三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而 PON1 L55 M基因型及等位基因頻率分布在腦梗死合并高血壓組與對照組和腦梗死無高血壓組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2值分別為8.271和4.114，P＜0.05），腦梗死合并高血壓組的M等位基因分布頻率顯著升高。

3 討論

腦梗死是在供應(yīng)腦的血管壁病變或血流障礙基礎(chǔ)上發(fā)生的急性腦損害，基本病因包括高血壓性腦小動脈硬化、腦動脈粥樣硬化、血管的先天發(fā)育異常，尚有遺傳性疾病、炎癥、中毒、代謝等導(dǎo)致的腦血管壁病變［5］。隨著人們對心腦血管疾病研究的不斷深入，越來越多的危險因素逐漸被人們所認(rèn)識，腦梗死是遺傳和環(huán)境因素共同作用的疾病，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)多種基因多態(tài)性與之有關(guān)，其中位于人類染色體7q21.3?q22.1的基因簇（PONs）是近年來的研究熱點。 其基因產(chǎn)物（PON?1，PON?2，PON?3）可能通過影響高密度脂蛋白（HDL）抗LDL氧化能力，抑制氧化的低密度脂蛋白LDL（OX?LDL）形成而減少LDL的氧化，破壞OX?LDL中溶血磷脂而降低OX?LDL水平，從而減輕及延緩AS進(jìn)程［6］。動脈粥樣硬化是合并頸動脈粥樣硬化斑塊腦梗死發(fā)病的病理基礎(chǔ)。

表1 腦梗死組與對照組PON基因型及等位基因頻率的分布

表2 動脈粥樣硬化性腦梗死合并高血壓患者的PON基因型及等位基因頻率的分布

PON?1基因多態(tài)性與酶活性密切相關(guān)，在一定程度上決定了其抗氧化能力，與動脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)。James等［7］發(fā)現(xiàn)PON?1基因啟動子 T?107C多態(tài)性強(qiáng)烈影響著PON?1的基因表達(dá)和血清水平，其中低表達(dá)基因型TT與血清低水平PON?1明顯相關(guān)。在對氧磷酶1基因編碼區(qū)還存在兩種常見的基因多態(tài)性，分別是 CGA／CAA置換導(dǎo)致 192位 Arg／Gln多態(tài)性（Q192R）和 ATG／TTG 顛換導(dǎo)致 54位 Met／Len多態(tài)性（L55M）。已有研究證實，PON1192Q／R基因型和酶活性與腦梗死的發(fā)生有關(guān)，但也有研究認(rèn)為兩者無關(guān)，研究結(jié)果的差異，可能與種族、地理、實驗方法、取樣本量的大小等因素有關(guān)。Ranade等［8］在一項2500例的大樣本研究中發(fā)現(xiàn)：PON1192Q／R基因型與腦卒中顯著相關(guān)，QR雜合子的OR值為2.28，RR純合子的OR值為2.47。因此得出結(jié)論P(yáng)ON1192Q／R基因型是腦梗死重要的危險因素。而Ueno 等［9］對日本人的研究發(fā)現(xiàn)：PON1192Q ／R 基因型的分布，在腦梗死患者中無差異。本實驗結(jié)果顯示腦梗死組與對照組之間Q192R基因型和等位基因頻率差異無顯著性。與Ueno結(jié)果一致，可能是PON1192Q／R基因型對腦梗死的影響常被種族、環(huán)境等因素所干擾。研究顯示55多態(tài)性純合子LL基因型與頸動脈變異的高發(fā)生率和嚴(yán)重程度相關(guān)，該基因型是AS性心血管疾病的獨立危險因素。本次實驗中發(fā)現(xiàn)本地區(qū)漢族人群PON1L／M55只存在LL、LM兩種基因型，以LL基因型為主，正常對照人群LL基因型占95%，L／M等位基因頻率分別為0.975和0.025。而以往報道在歐美白種人群中，L／M等位基因頻率為 0.6～0.7／0.3 ～ 0.4［9-10］，亞洲華人和日本人 L／M 等位基因的頻率為0.92／0.0816。相比較可發(fā)現(xiàn)本地區(qū)漢族人L／M等位基因分布趨勢與國外報道的華人和日本人群的分布基本相一致，但L等位基因頻率較高，M等位基因頻率較低，在腦梗死組合并高血壓與對照組及無高血壓組的對比研究中亦發(fā)現(xiàn)，PON155M等位基因有明顯差異，說明M等位基因不僅是腦梗死發(fā)生的危險因素，更是腦梗死合并高血壓的危險因素之一。提示PON1L／M55基因分布可能由于不同的遺傳背景而存在明顯種族和個體差異。

本研究結(jié)果表明PON1 L55 M等位基因可能與腦梗死合并高血壓患者的危險性增高有關(guān)，與國內(nèi)外某些研究結(jié)果不一致，可能是因為入選人群所處地理環(huán)境、飲食習(xí)慣及種族之間差異影響了PON基因型及基因頻率的分布，并且樣本量較少時有可能低估某些在人群中出現(xiàn)頻率相對較低的基因型在生化指標(biāo)和臨床表型方面的影響。PON基因多態(tài)性及其基因變異在動脈粥樣硬化過程中的確切作用機(jī)制尚有待于更深入的研究，明確他們之間的關(guān)系將為動脈粥樣硬化性疾病的早期診斷及防治提供一條有意義的途徑，可為缺血性腦血管病的基因診斷、疾病預(yù)防和基因治療提供參考依據(jù)。

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