邢夢娟 Dake Qi 張成芳 丁文華 江開達 馬端 崔東紅

第二代抗精神病藥物（second generation antipsychotics，SGA）奧氮平是治療各種精神疾病尤其是精神分裂癥、雙相情感障礙等最廣泛的臨床用藥之一。在其表現(xiàn)出很強的抗精神病作用、較少神經(jīng)系統(tǒng)副作用的同時，卻引起代謝障礙的不良反應，如體重增加、胰島素抵抗、糖尿病、心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）等［1，2］，而后者是精神分裂癥患者死亡的主要原因［3］。臨床［4］、隊列［5］及流行病學研究［6］均提出SGA可以增加CVD風險，甚至引起致死性心臟?。?］，但具體的機制尚不清楚。MIF是第一個被發(fā)現(xiàn)的細胞因子，參與多種炎癥反應，在心血管疾病中也發(fā)揮關鍵的作用［8］，甚至有學者提出 MIF在 CVD的發(fā)病中起直接作用［9］。Schober等［10］應用 MIF基因敲除小鼠的研究也指出MIF可能就是動脈粥樣硬化的病因。然而抗精神病藥物引起的心血管事件是否通過MIF通路尚無報道。本研究采用培養(yǎng)的大鼠心肌細胞來探索奧氮平是否影響大鼠H9C2心肌細胞MIF的表達，為探討奧氮平誘導心血管疾病的機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 大鼠心肌細胞H9C2（H9C2細胞系，ATCC號CRL-1446上海中科院）

1.1.2 實驗藥品 奧氮平純品（大連美侖）。奧氮平用DMSO溶解，加到不含血清的DMEM基礎培養(yǎng)基中，分別配成含40、20和10 umol奧氮平的培養(yǎng)液，DMSO最終濃度不超過0.1%，對照培養(yǎng)液含相同濃度DMSO。

1.1.3 實驗試劑 胎牛血清（Bioind），DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco），兔抗鼠單克隆 MIF 抗體（chemokine），兔抗鼠 GAPDH抗體（fermentas），羊抗兔 IgG-HRP（fermentas）、預染蛋白 marker（fermentas），Trizol試劑 （invitrogen），ECL發(fā)光盒 Pierce ECL Western Blotting Substrate （thermo），PrimeScript?RT reagent Kit（Takara），熒光染料 SYBR Green I（ABI）、引物由invitrogen公司合成（見表1）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) H9C2細胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.2.2 奧氮平處理 H9C2細胞用0.5%血清的培養(yǎng)基饑餓24 h，再加入不同濃度奧氮平培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，取變化最明顯的濃度40 umol為固定濃度，將細胞培養(yǎng) 1、3、12和 24 h，所有實驗設置未用奧氮平處理組為對照組（con），用Trizol收集細胞并放在－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 總 RNA的提取及逆轉錄合成 cDNA 氯仿－異丙醇法抽提總mRNA，用752紫外光柵分光光度計測定樣本的總RNA純度及濃度后樣本保存于－80℃冰箱備用。按照逆轉錄試劑盒說明書操作步驟，合成第1鏈cDNA后凍存于－20℃中備用。

1.2.4 SYBR Green I熒光染料 RT-qPCR 定量檢測 使用SYBR Green I熒光染料法在384孔ABI Prism 7900 序列檢測系統(tǒng)（Applied Biosystems，CA）上熒光實時定量PCR擴增，分析MIF基因表達。為控制不同樣本間的基因表達差異，用管家基因3－磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)對照基因，來標化目的基因的表達（以GAPDH作為內(nèi)對照基因，計算MIF基因mRNA相對定量即2－△△CT）。每個樣本的MIF基因和內(nèi)對照GAPDH基因均重復3次。熒光實時定量 PCR擴增體系共 10 μL：SYBR Green I PCRMastermix5μL，上、下游 Primer計0.8μL，RNasefree H2O 3.2 μL，cDNA 模板 1 μL。 熒光實時定量PCR 用 2步法，擴增條件：95℃ 10 min，95℃ 30s、60℃1 min、72℃1 min、40個循環(huán)。采用比較循環(huán)數(shù)（cycle threshold，CT）的方法相對定量［15］。 熒光定量PCR的結果以CT值顯示，CT值為每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)?！鰿T值＝單樣本平均目標基因CT值—單樣本平均GAPDH基因CT值。以2－△△CT代表目的基因的表達水平（每個樣本的△△CT＝每個樣本的平均△CT一對照組的平均△CT）來計算表達差異的倍數(shù)。每次實驗重復3次。

表1 用于RT-PCR及qRT-PCR的引物序列

1.2.5 蛋白印跡 冰上提取組織總蛋白，用BCA法測定蛋白質(zhì)含量；用5X蛋白loading buffer（LB）將總蛋白配置成含1XLB的蛋白上樣液，在100℃的block中煮沸5 min，室溫下冷卻后凍存于－80℃?zhèn)溆?。配?2%的SDS-PAGE凝膠，用濕轉法將蛋白電轉到PVDF膜上；5%脫脂奶粉常溫封閉1 h；加入 MIF、GAPDH 一抗（1 ∶2000，1 ∶5000），在 4℃冰箱中孵育過夜，TBST漂洗10 min×3次，加入二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG）室溫孵育1 h，TBST漂洗10 min×3次，混均ECL顯影液后在Fuji las3000顯影儀中將免疫復合物顯影。用計算機圖像分析系統(tǒng)軟件IMAGE J分析測定MIF及內(nèi)參照GAPDH，比較MIF的積分光密度比值。

1.2.6 統(tǒng)計分析 應用 SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用（）表示，采用獨立樣本t檢驗比較不同處理組與對照組間的差異；采用one-way ANOVA方差分析方法，以不同處理方式做為組間因素，比較不同處理對MIF表達趨勢的影響，檢驗水準 ɑ＝0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 H9C2細胞用奧氮平處理后，MIF在mRNA水平表達升高 H9C2細胞用奧氮平在不同濃度處理（F ＝ 12.197，P ＝ 0.002）和不同時間處理（F ＝93.038，P ＜ 0.01） 后，MIF mRNA 的表達呈顯著升高的變化趨勢。用不同濃度的奧氮平處理H9C2細胞24 h，MIF的mRNA表達水平隨著奧氮平處理濃度的增加而升高；在奧氮平濃度為40 umol時，MIF表達量最高（P＜0.01）；當固定奧氮平處理濃度時（40 umol），MIF的mRNA表達也隨著處理時間的延長呈遞增趨勢，在處理時間為24 h時，MIF的表達增加最顯著（P＜0.01）。奧氮平誘導H9C2細胞MIF的mRNA表達水平升高，這種升高與奧氮平的濃度及處理時間存在依賴關系（見圖1）。

圖1 H9C2細胞用奧氮平處理后MIF mRNA表達改變

2.2 H9C2細胞用奧氮平處理后，MIF在蛋白水平表達升高 H9C2細胞用奧氮平在不同濃度處理（F ＝ 10.713，P ＝ 0.004）和不同時間處理（F ＝56.708，P ＜ 0.01）后，MIF 蛋白的表達呈顯著升高的變化趨勢（見圖2）。用奧氮平處理H9C2細胞24小時，MIF蛋白表達水平隨著奧氮平處理濃度的增加而增加，在濃度為40 umol時，MIF在蛋白的表達水平最高（P ＜ 0.01，見表 2）；當固定奧氮平處理濃度時為40 umol時，隨著處理時間的延長，MIF的蛋白表達也逐漸增加，在處理時間為24 h時，MIF的蛋白表達增加最顯著（P ＜ 0.01，見表 2）。奧氮平處理誘導H9C2細胞的MIF在蛋白表達水平升高，這種升高與奧氮平處理存在濃度與時間的依賴關系。

圖2 H9C2細胞用奧氮平處理后MIF蛋白表達改變

表2 蛋白印跡的MIF的積分光密度比值 （）

表2 蛋白印跡的MIF的積分光密度比值 （）

1）：與對照組相比，經(jīng)單因素方差分析方法檢驗，P＜0.052）：與對照組相比，經(jīng)單因素方差分析方法檢驗，P＜0.01

組別按濃度分組按處理時間分組10 umol 20 umol 40 umol 1 h 3 h 12 h 24 h n3333333 MIF的積分光密度比值1.16 ± 0.141.36 ± 0.181）1.50 ± 0.132）1.13 ± 0.081.39 ± 0.981.55 ± 0.951）1.98 ± 0.122）

3 討論

奧氮平的抗精神病作用確切，神經(jīng)系統(tǒng)副作用較少，臨床應用日益廣泛，由于部分患者用藥出現(xiàn)的代謝紊亂及CVD風險，嚴重影響了患者對該藥的依從性，制約了其臨床使用。臨床研究顯示精神分裂癥患者較正常人的預期壽命縮短20%，而2／3以上的患者死于冠心?。ㄕＨ巳簽?1 ／2）［11］。一項包括18個研究的Meta分析表明CVD是精神分裂癥患者的主要死亡原因［3］。臨床也反復證實SGA可誘發(fā)嚴重的CVD。但SGA誘發(fā)CVD的機制目前尚不清楚。傳統(tǒng)觀點認為CVD是SGA誘發(fā)代謝障礙的后果，SGA通過拮抗中樞組胺、5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)增加代謝障礙易感性，加劇肥胖、糖尿病、高脂血癥的發(fā)生，從而增加CVD的風險。然而，臨床上有部分患者在沒有代謝障礙的情況下仍然發(fā)生CVD，因此，還存在傳統(tǒng)觀點無法解釋的SGA致CVD機制。

MIF作為一種多效的細胞因子，在免疫、炎癥、代謝、損傷修復等病理生理過程中發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)MIF在CVD中有重要作用，臨床研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化、急性心肌梗死、冠心病等患者血清高MIF水平［12］；動物研究也發(fā)現(xiàn)MIF在動脈粥樣硬化動物模型的血管平滑肌中也表達升高［13］。在MIF基因敲除的動物模型中不易誘發(fā)動脈粥樣硬化，以上研究從多個層面揭示了MIF與CVD之間的聯(lián)系。但其深層次的機制目前尚不清楚，目前MIF在心臟損傷中的作用結論相互矛盾，有研究認為MIF對心肌具有損傷作用，如在正常情況下，培養(yǎng)基中少量的MIF可以引起心肌調(diào)亡，MIF可能通過加速心肌的凋亡導致心衰［14］。MIF敲除小鼠炎癥反應降低，從而減少了心肌缺血再灌注損傷［15］，提示MIF可能參與心肌缺血再灌注損傷。但也有研究認為MIF升高后活化磷酸腺苷激活蛋白激酶AMPK而對心肌細胞起保護作用［16］或通過減弱氧化應激反應來保護心臟缺血再灌注損傷［17］。

本研究發(fā)現(xiàn)，用奧氮平處理大鼠心肌細胞H9C2用后，MIF表達在mRNA與蛋白水平均升高，且MIF的表達變化與奧氮平處理的濃度和處理的時間存在數(shù)量依賴關系，提示奧氮平可以誘導心肌細胞分泌MIF，推測MIF在奧氮平誘發(fā)的CVD中可能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，但作用機制尚有待進一步深入研究。因此，本研究存在一定的缺陷，本研究僅發(fā)現(xiàn)奧氮平處理心肌細胞后MIF表達升高這一現(xiàn)象，推測MIF可能參與奧氮平誘導的心肌損傷。而MIF升高在奧氮平誘導CVD中起何種作用、機制如何尚未研究。此外，細胞研究是一個獨立微觀水平的研究，其結果能否在動物水平及人體水平研究中重現(xiàn)，仍需進一步的研究證實。雖然本研究尚存在以上不足，但發(fā)現(xiàn)奧氮平在心肌細胞模型上可以誘導MIF的高表達，據(jù)我們所知，目前尚無這方面的報道，本研究結果為今后深入研究奧氮平誘導的CVD的機制提供了部分依據(jù)。

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