胡躍強(qiáng) 唐農(nóng) 董少龍 劉尊敬 祝美珍 胡玉英 范立雷

腦缺血預(yù)處理（brain ischemic preconditioning，BIP）是近年發(fā)現(xiàn)的重要內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，可使腦組織對以后較長時(shí)間的缺血性損傷產(chǎn)生顯著的耐受［1］。最近有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在此環(huán)節(jié)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其中 C／EBP 同源蛋白（C／EBP homology protein，CHOP）表達(dá)的增加是ERS的標(biāo)志之一，它參與了細(xì)胞凋亡的過程［2］。本研究意在通過檢測局灶性BIP后CHOPmRNA及其蛋白在腦內(nèi)的表達(dá)變化，以進(jìn)一步研究BIP的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物分組與處理 健康雄性SD大鼠180只，體質(zhì)量（250±50）g，隨機(jī)將大鼠分為3組：假手術(shù)組（SO）、大腦中動脈缺血組（MCAO）、腦缺血預(yù)處理組（BIP）。 每組按照再缺血后 12 h、1 d、2 d、3 d四個時(shí)間點(diǎn)平均分為4個亞組（n=15）。分別作如下處理：SO組：以假手術(shù)代替預(yù)缺血及缺血再灌注；MCAO組：以假手術(shù)代替預(yù)缺血，其余步驟同BIP組；BIP組：MCAO 10 min后抽出栓線，完成預(yù)缺血，3 d后再次行MCAO 2 h，再灌注后12 h、1 d、2 d、3 d 處死大鼠。

1.2 動物模型與標(biāo)本制備 參照Longa的線栓法進(jìn)行造模。采用大腦中動脈二次線栓法［3］制備大鼠腦缺血預(yù)處理模型，結(jié)扎左側(cè)頸外動脈遠(yuǎn)端，在結(jié)扎線近端距分又5 mm處剪口，將尼龍線從頸外動脈殘端插入至頸總動脈分叉部以上19～20 mm，結(jié)扎頸外動脈近心端，10 min后抽出栓線，完成缺血預(yù)處理。3 d后再次行MCAO 2 h，再灌注后規(guī)定時(shí)間點(diǎn)處死動物取腦。

1.3 缺血半暗帶腦皮質(zhì) CHOP mRNA表達(dá)測定 原位雜交法。按試劑盒說明進(jìn)行操作。采用HMIAS?2000高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)測定CHOP mRNA原位雜交染色的灰度值。主要在頂葉缺血半暗帶陽性細(xì)胞做比較，染色越深，灰度值越小，mRNA表達(dá)越多。每張切片測定4個視野（400×），取平均值。

1.4 缺血半暗帶腦皮質(zhì)內(nèi)CHOP蛋白表達(dá)測定 大鼠斷頭取腦并分離缺血側(cè)頂葉大腦皮質(zhì)約100 mg，研磨后加入蛋白裂解液，然后4℃12000 r／min 離心 30 min，提取總蛋白，取蛋白樣品 40 μg經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。然后依次加入兔抗CHOP抗體（Bioworld公司），4℃ 孵育過夜；偶聯(lián)有辣根過氧化物（HRP）羊抗兔IgG（Amersham公司）室溫孵育2 h，滴加ECL顯色液，Bio?Rad凝膠成像儀曝光、顯像。采用HMIAS?2000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，獲取各組Western blot條帶的平均光密度（OD）值，內(nèi)參為GAPDH，目的蛋白與內(nèi)參光密度比值即為目的蛋白的相對值。

1.5 神經(jīng)細(xì)胞凋亡率檢測 大鼠迅速斷頭取腦，分離缺血半暗帶腦組織100 mg，1.25 g／L胰蛋白酶消化后制備單細(xì)胞懸液，70%乙醇4℃過夜固定樣品，次日離心棄乙醇收集細(xì)胞，加入50 mg／L RNase，37℃孵育 30 min，再加入 50 mg／L PI（美國 KPL 公司），4℃避光染色30 min，300目篩網(wǎng)過濾，利用美國貝克曼-庫爾特FC 500流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)10000個細(xì)胞，測定各期細(xì)胞DNA含量并計(jì)算凋亡細(xì)胞所占比例。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0處理數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)以表示，組間比較用方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 CHOP mRNA表達(dá)變化 原位雜交顯示：SO組有少量CHOP mRNA表達(dá)；MCAO組大鼠腦缺血再灌注后12 h缺血半暗帶CHOP mRNA表達(dá)達(dá)高峰（P＜0.01），隨再灌注時(shí)間延長其表達(dá)逐漸下降，但仍保持較高表達(dá)水平 （P＜0.01）；BIP組缺血后各時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)水平較MCAO組均明顯下降（P＜0.05）。 見表 1、圖 1。

表1 大鼠頂葉皮層CHOP mRNA表達(dá)的灰度值

圖1 缺血半暗帶CHOP mRNA的表達(dá)（原位雜交）

2.2 CHOP蛋白表達(dá)的變化 Western blot顯示：SO組有少量CHOP蛋白表達(dá)；MCAO組12 h缺血半暗帶CHOP蛋白表達(dá)開始顯著增加，24 h達(dá)高峰（P＜0.01），隨再灌注時(shí)間延長其表達(dá)逐漸下降，但仍保持較高表達(dá)水平（P＜0.01）；BIP組缺血各時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)水平均顯著降低（P ＜ 0.05，P ＜ 0.01）。見表 2、圖 2。

表2 大鼠頂葉皮層CHOP蛋白表達(dá)的光密度值

圖2 CHOP蛋白的表達(dá)（Western blot）

2.3 神經(jīng)細(xì)胞凋亡率變化 流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期定量分析表明，SO組未見明顯的凋亡峰，其細(xì)胞凋亡百分率很低。腦缺血再灌注12 h后，MCAO組缺血半暗帶細(xì)胞凋亡發(fā)生率較SO組顯著增加（P＜0.01），1 d時(shí)達(dá)到高峰，以后時(shí)間點(diǎn)逐漸下降，但仍高于SO組（P＜0.01）；BIP組各個時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元凋亡發(fā)生率較MCAO組顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。說明BIP具有減輕腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡的作用。見表3。

3 討論

腦缺血預(yù)處理（BIP）是指對腦組織采用機(jī)械刺激，如一次或多次短暫性腦缺血再灌注后，誘導(dǎo)腦組織產(chǎn)生內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，使其對以后較長時(shí)間的缺血性損傷產(chǎn)生顯著的耐受，這種現(xiàn)象又稱為腦缺血耐受。最近有研究發(fā)現(xiàn)BIP可激發(fā)適當(dāng)?shù)膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS），增強(qiáng)細(xì)胞耐受后繼長時(shí)間缺血刺激的能力，延緩或減輕I／R造成的組織損傷，并認(rèn)為ERS可能是腦缺血細(xì)胞損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［4］。腦缺血后ERS激活并可誘導(dǎo)CHOP／Gadd153等未折疊蛋白反應(yīng) （UPR）靶基因在缺血后表達(dá)［5］，引起細(xì)胞凋亡。其可能機(jī)制如下：①內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白IRE1和ATF6活化［6］，其胞漿活性部分進(jìn)入核內(nèi)，與ERS反應(yīng)元件相連，啟動CHOP轉(zhuǎn)錄與表達(dá)［7］；②通過PERK-eIF2a途徑活化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子ATF4和ATF3表達(dá)，前者結(jié)合氨基酸調(diào)控元件，再誘導(dǎo)CHOP表達(dá)。CHOP可能通過下調(diào)Bcl-2表達(dá)、耗竭谷胱甘肽、促進(jìn)活性氧族產(chǎn)生等，活化Caspase-12，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［8］。CHOP基因敲除可增強(qiáng)細(xì)胞對抗ERS所致凋亡的能力；相反，CHOP過度表達(dá)的細(xì)胞則對ERS所致凋亡更為敏感。

表3 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率

己有研究在腦缺血再灌動物模型中檢測出CHOP表達(dá)增加。如Yuan等［9］制作大鼠短暫性全腦缺血模型，阻斷腦血流30 min后再灌注，結(jié)果顯示再灌注6 h至24 h大腦皮層缺血半暗帶CHOP蛋白表達(dá)逐漸增加，再灌注24 h達(dá)高峰；Jin等［10］利用微陣列分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)大鼠海馬部位CHOPm?RNA 在再灌注 4 ～ 24 h 表達(dá)增加；Tajiri等［11］將野生型及CHOP-／-小鼠制成永久性腦缺血模型，檢測CHOPmRNA及其蛋白在野生型小鼠紋狀體及海馬的表達(dá)以，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)術(shù)后12 h CHOPmRNA表達(dá)顯著增加，術(shù)后24 h在受損神經(jīng)元胞核內(nèi)檢出CHOP蛋白表達(dá)，而CHOP-／-小鼠7 d后海馬和紋狀體的神經(jīng)細(xì)胞死亡較對照組有實(shí)質(zhì)性的減少，這些結(jié)果均說明缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡與CHOP有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血120 min再灌12 h缺血側(cè)頂葉皮層CHOPmRNA表達(dá)達(dá)高峰，隨再灌注時(shí)間延長其表達(dá)逐漸下降，再灌注72 h仍可見其高表達(dá)，其蛋白表達(dá)于再灌24 h達(dá)高峰，提示大鼠缺血再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）損傷誘發(fā)的ERS可誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)。與相關(guān)研究報(bào)道基本一致［9-10］。結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞凋亡率在I／R后1 d時(shí)達(dá)到高峰，提示I／R后CHOP表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。而BIP干預(yù)后其表達(dá)均有明顯的下降，提示BIP可能通過影響ERS后CHOP的表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。其機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。

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