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豬繁殖障礙與呼吸道綜合癥RT-PCR檢測方法的建立及初步應用

楊斌 （云南省昆明市動物疫病預防控制中心 661000）白衛(wèi)兵 （云南農業(yè)大學動物科學技術學院 云南 昆明）沈學文*（云南省紅河州動物疫病預防控制中心 云南 蒙自）

為建立PRRSV的檢測方法并實現(xiàn)不同病料檢測的實際應用，根據(jù)Genbank中PRSSV的高度保守性序列來設計并合成一對引物，擴增片段大小為372bp。通過對組織、血液、精液3種不同病料提取RNA，對RT-PCR中不同反應條件進行試驗，確定了PRSSV最佳檢測反應體系。

豬繁殖障礙與呼吸道綜合征病毒 RT-PCR 建立 應用

豬繁殖障礙與呼吸道綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖障礙與呼吸道綜合征病毒(PRRsV)引起的豬的疫病，俗稱“藍耳病”。以母豬發(fā)熱、厭食與流產、死產、木乃伊胎和產弱仔等繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征。該病從1987年首次在美國發(fā)現(xiàn)以來，迅速傳播至全世界養(yǎng)豬發(fā)達的國家與地區(qū)。目前我國將其定為二類傳染病，因其造成母豬繁殖障礙、仔豬死亡及免疫機能障礙，給國內養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[1]。

快速診斷是有效防制該病的首要前提。常規(guī)的病原學和血清學檢測方法不僅特異性差、敏感性低、耗時長、操作繁瑣，臨床上還易與豬瘟、偽狂犬病、細小病毒病和布病等疾病相混淆。為了有效控制該病的發(fā)生，建立一種快速、準確、敏感的病原檢測方法顯得十分必要。PCR技術是模仿體內DNA復制過程的基因體外擴增技術，該技術以其快速、特異、敏感、簡便、產量高和易于操作等突出的優(yōu)點，不僅消除了常規(guī)血清學診斷方法的低敏感性，還可以從分子水平直觀快速的檢測到病毒核酸的存在。建立PRRSV的RT-PCR早期快速診斷檢測方法，并用該方法對各種臨床樣品進行檢測，可為PRRS的防制提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酶類及試劑 血液(液體樣本)總RNA快速提取試劑盒(BioTake)、TRIZOL LS Reagent、氯仿、異丙醇、75%乙醇、Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、100 bp DNA Ladder Marker、DNA Marker DL2000、溴化乙錠(EB)、DEPC水、瓊脂糖等；試驗所涉及的引物由大連寶生物工程公司合成。

1.1.2 儀器設備 三恒多用電泳儀(DYY-Ⅲ12)、水平電泳裝置、凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 1600)、PCR儀(MinicyTM，MJ Research)、高速臺式冷凍離心機(PrimoR，Gene Company Limited基因有限公司)、微波爐(SANYO，EM-500S)、超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司制造)、組織研磨器具、HH-42水浴鍋(常州市華普達教學儀器有限公司)、電子天平、移液槍、旋渦震振器等。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 PRRSV檢測引物設計：根據(jù)相關參考文獻，在GenBank中查出PRRSV多個全基因序列，在NCBI中BLAST比對，根據(jù)PRSSV的高度保守性序列來設計。利用計算機軟件中的Primer5、Oligo6和DNA star等軟件進行引物設計。在設計PRRSV引物時，充分考慮PCR要求(引物G+C含量、引物長度、Tm值等)，設計檢測PRRSV引物。定名為LR1(上游引物)，LR2(下游引物)。

1.2.2 病毒核酸提取 提取RNA所用的各類槍頭、離心管、吸水紙等都是經(jīng)過DEPC水處理過，不含有RNA酶，所有操作均帶一次性手套在超凈工作臺中操作。（1）血液樣品RNA的提?。豪醚?液體樣本)總RNA快速提取試劑盒(BioTake)進行提取RNA。打開高速臺式冷凍離心機(PrimoR，Gene Company Limited 基因有限公司)2000r/ min30min，使溫度降到4℃。取0.25ml裝在抗凝管中的新鮮血液加入到潔凈、無RNA酶的1.5ml的離心管中，與0.75ml TRIpure LS Reagent試劑混合均勻，使病毒裂解。將上述混合物15~30℃孵育5min，4℃，12000rpm離心10min，小心取上清轉入新的離心管中，加入氯仿0.35ml混勻，震蕩15S，15~30℃孵育3min。4℃，12000rpm離心10min。離心混合物分出淡紅色酚仿、中間相、上層無色水相，取上層水相轉移到一支潔凈的離心管中(注意不可吸取中下層)，加等體積的70%乙醇，混勻后一起轉入吸附柱RA中。4℃，10000rpm離心1min，棄掉收集管中的廢液，然后加入0.5ml的去蛋白液RE，15~30℃孵育5min，4℃，12000rpm離心1min；棄掉收集管中的廢液，然后加入0.7ml的漂洗液RW，15~30℃孵育2~5min，4℃，12000rpm離心1min；棄掉收集管中的廢液，然后加入0.5ml的漂洗液RW，15~30℃孵育2~5min，4℃，12000rpm離心1min；將吸附柱RA放入空收集管中，4℃，12000rpm離心2min，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留的乙醇抑制下游反應。取出吸附柱RA放入一個新的潔凈離心管中，吸取65~75℃預熱的RNase free water 加入RA中間，15~30℃孵育2~3min，4℃，12000rpm離心1min；為了得到更多的RNA可以再離心一次，-20℃凍存?zhèn)溆谩＃?）組織樣品RNA的提?。哼M行研磨用的研缽和錘子(都用錫箔紙包裹著)，剪子都是經(jīng)過DEPC水處理過的不含RNA酶并且保存在-20℃中，組織樣品(PRRSV在肺臟中病變明顯)150mg進行處理，剪碎研碎加入適量MEM培養(yǎng)基后再研磨成勻漿，轉移到新的潔凈的1.5ml離心管中，在-20℃反復凍融2~3次。加入Trol(裂解液)0.9ml，混勻15~30℃孵育5min，4℃，12000rpm離心10min，取上清移入新的潔凈的離心管中，加入0.5ml的氯仿，輕輕混勻15~30℃孵育2~3min，4℃，12000rpm離心10min，取上清移入新的潔凈的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻15~30℃孵育10min，4℃，12000rpm離心10min，可見管底有沉淀。棄上層液體，保留沉淀加入1ml 75%的乙醇，潤洗然后棄乙醇用一次性吸水紙吸掉殘存的乙醇，放置1~2min，加入0.1%的DEPC處理過的水(RNA free water)30~60微升。-20℃凍存?zhèn)溆?。?）公豬精液樣品RNA的提?。鸿b于采取的公豬精液樣品一般是用水稀釋過的，精子濃度較低，因此需要把樣品混勻后取1ml左右放入新的潔凈的離心管中離心3000r/min離心1~2min然后棄上層液體，再重新吸取樣品1ml再離心續(xù)沉，反復幾次以獲得高濃度精子的樣品。加入Trol(裂解液)0.9ml，混勻15~30℃孵育5min，4℃，12000rpm離心10min，然后與組織樣品RNA的提取方法一致。

1.2.3 PRRSV病毒cDNA的合成(RT) ①在PCR管中配制以下試劑：提取的血液、組織、公豬精液樣品的PRRSV RNA模板10μl。PRRSV(LR2)下游引物2μl。②在PCR儀中70℃保溫10min，迅速在冰水上急冷2min。③混勻上述液體，在掌上離心機離心數(shù)秒使混合液聚集管底。④在上述PCR管中配制下列反應液：5M*MLV Buffer4μl；10mM dNTP mixture 1μl；RNase Inhibitor(40u/μl)0.5μl；RTase M-MLV(200U/μl)，0.5μl；Rnase free water，補足至20μl。在PCR儀器中42℃保溫1h，70℃保溫15min，然后0℃冷卻，既得PRRSV的cDNA溶液。注：RT過程中體系的配制需在冰盒上進行并且配帶一次性手套防止RNA酶污染。

1.2.4 PRRSV的RT-PCR方法建立 PCR反應體系為25μl：10×R Taq Buffer 2.5μl；dNTPs(2.5mmol/L)1μl；LR1(10μmol/L)0.5μl；LR2(10μmol/L)0.5μl；反轉錄產物，血液0.5μl、組織0.5μl、精液1μl；Ex Taq(5U/μl) 0.25μl；ddH2O，19.75μl、19.75μl、19.25μl。PCR擴增程序為：（1）94℃預變性5min；（2）94℃變性30s；（3）59℃退火30s；（4）72℃延伸30s；（5）為33個循環(huán)；（6）72℃延伸5min。循環(huán)結束后取PCR產物5用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察擴增結果。

1.2.5 PRRSV的RT-PCR反應條件范圍確定(以血液PRRSV cDNA為例) （1）引物濃度的確定：將合成的引物(固體)稀釋成貯存濃度(100μM)，然后分裝成工作濃度(10μM)，分別選擇引物量加入0.3μl，0.5μl和1μl。（2）dNTPs濃度的確定：分別加入dNTP量為0.5μl，1μl和2μl對血液PRRSV進行PCR擴增，確定dNTP最適濃度。（3）R Taq酶濃度的確定：分別使用R Taq酶量為0.25μl，0.5μl和1μl對血液PRRSV進行PCR擴增，確定R Taq酶適宜濃度。（4）被檢樣品質量對RT-PCR檢測的影響：比較陳舊被檢樣品與新鮮被檢樣品在RT-PCR檢測中的差異。（5）RT-PCR退火溫度的確定：分別進行了以53℃，55℃與59℃不同退火溫度PCR試驗，確定PCR反應的最佳退火溫度。（6）模板量的確定：對于組織樣品模板量cDNA，0.5μl，1μl和2μl進行PCR擴增；對于血液樣品模板量cDNA，0.5μl，1μl和2μl進行PCR擴增；對于精液樣品模板量cDNA，0.5μl，1μl和2μl進行PCR擴增。

1.2.6 RT-PCR產物鑒定 （1）PCR產物電泳與回收純化：PCR產物于1.5%的瓊脂糖凝膠120V電泳30min進行鑒定，如有目的條帶再進行大擴，取約50~80μl PCR產物于1.5%的瓊脂糖凝膠85V電泳1h，然后進行切膠。用多功能DNA純化回收試劑盒(北京百泰克生物技術公司生產)對目的片段進行回收純化。具體操作請按照膠回收試劑盒說明書來操作。（2）PCR產物的連接：將PCR產物與pMD 18-T Vector T載體連接，按照試劑盒(pMD 18-T Vector Kit，Promega公司)說明進行操作。反應體系(25μl)如下：T載體(30ng/μl)1μl；T4DNA連接酶1μl；10*T4 DNA Ligase Buffer2.5μl；回收DNA片段適量10μl；ddH2O，10.5μl；于16℃反應14~16h。（3）轉化：在冰水中融化一支DH5α感受態(tài)細胞，將10μl連接產物加入其中并輕輕混勻，冰浴30min，42℃熱沖擊45~60s后，立即冰浴2min，加940μl LB培養(yǎng)基(室溫條件)，37℃振搖225rpm 1h。離心使取下層渾濁液在瓊脂板(50μg/ml Amp)均勻涂布后，待菌液吸干，置于37℃培養(yǎng)過夜。（4）搖菌：在無菌條件下，用接種環(huán)挑取單個菌落，接種到試管液體氨芐抗性的液體培養(yǎng)基中，37℃振搖225rpm過夜。（5）提取質粒和酶切鑒定：質粒的小量制備(堿裂解法)：在無菌條件下，將培養(yǎng)物轉入1.5ml的微量離心管中，6000rpm離心3min，將管倒置于吸水紙上，盡可能地吸去殘留的培養(yǎng)液。用100μl冰預冷的溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·Cl pH8.0，10mmol/L EDTA)重懸細菌沉淀。加入200μl新配制的溶液Ⅱ(0.2mol/L NaOH，1% SDS)，顛倒數(shù)次混勻，加入150μl冰預冷的溶液Ⅲ(3mol/L KAC，5mol/L冰乙酸)，顛倒混勻，冰浴5min，4℃ 12000rpm離心10min。取上清分別加等量飽和酚、飽和酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)、氯仿:異戊醇(24:1)各抽提一次，最后取上清加2倍體積冷無水乙醇，混合均勻，-20℃放置30min，12000rpm離心10min，棄上清，將沉淀用70%冷乙醇洗滌兩次(注意沉淀不要被洗丟)，室溫干燥，用20μl含終濃度20μg/ml無DNA酶的RNA酶(10mg/ml)的TE (10mmol/L Tris·Cl pH8.0，1mmol/L EDTA)溶解沉淀，37℃水浴30min，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，置-20℃保存?zhèn)溆谩Ｃ盖需b定：將理論目的片段序列和PMD-18T序列用DNAStar分析酶切位點，選用合適的內切酶來確定目的片段是否連入連對。酶切鑒定后送上海生工測序。

2 結果

2.1 引物

本試驗設計出符合要求的PRRSV檢測引物，兩端添加了相應的Bam HI Hind III限制性酶切位點，針對PRRSV的ORF7設計的引物如下：LR1(上)：5’-gcggatccccaaataac aacggcaagc-3’(27bp)；LR2(下)：5’-gcaagctttcatgttgggggtg atgctg-3’(28bp)；擴增片段大小為372bp。

2.2 組織，血液，精液樣品的RNA

如圖1、2、3。

圖1 組織樣品提取的RNA

圖2 血液樣品提取的RNA A

圖3 精液樣品提取的RNA

2.3 PRRSV的RT-PCR方法建立

2.3.1 組織，血液，精液樣品RT-PCR擴增結果 如圖4、5、6所示。

圖4

1：為Marker2000；2：為組織樣品RT-PCR目的片段；3：為陰性對照

圖5

1：為血液樣品RT-PCR目的片段；2：為陰性對照；3：為DNA Marker1

圖6

1：為Marker2000；2：為精液樣品RTPCR目的片段；3：為陰性對照

2.3.2 RT-PCR反應條件范圍確定 （1）引物濃度的確定：如圖7所示，適合于PRRSV的RT-PCR反應的最佳引物加入量為0.5μl。（2）dNTPs濃度的確定：如圖8所示，適合于PRRSV的RT-PCR反應體系的dNTPs最佳加入量為1μl。（3）R Taq酶濃度的確定：如圖9所示，適合于PRRSV的RT-PCR反應體系的R Taq酶加入量為0.5μl。（4）被檢樣品質量對RT-PCR檢測的影響：本試驗比較了陳舊被檢樣品與新鮮被檢樣品在RT-PCR檢測中的差異，結果顯示：陳舊被檢樣品與新鮮被檢樣品相比，提取的RNA易降解且PCR產物電泳效果較差(如圖10、11所示)，RT-PCR反應重復性差。因此無論是在建立RT-PCR檢測方法的實驗中，還是在診斷試劑應用過程中，盡可能保證被檢樣品的新鮮，以提高檢測的準確率。（5）單相RT-PCR退火溫度的確定：以PRRSV為例，分別進行了以53℃，55℃與59℃不同退火溫度試驗，試驗證明選用59℃作為PCR反應的退火溫度，PCR產物特異性比較好(如圖12所示)。（6）模板量的確定：組織樣品與精液樣品PRRSV的RT-PCR反應條件基本與血液樣品相似，精液樣品提取的RNA量少，因此在PCR時取的反轉錄產物最適宜量1μl，而血液和組織所取的RT產物都為0.5μl的模板量(如圖13、14、15所示)。

圖7

1：為引物加入量為1μl；2：為引物加入量為0.5μl；3：為引物加入量為0.3μl；4：為DNAMarker1

圖8

1：為dNTP加入量為2μl；2：為Marker2000；3：為dNTP加入量為1μl；4：為dNTP加入量為0.5μl

圖9

1：為加入Rtag酶量1μl；2：為加入Rtag酶量0.5μl；3：為加入Rtag酶量0.25μ；4：為Marker2000

圖10

1：為新鮮病料提取的RNA；2：為陳舊病料提取的RNA

圖11

1：新鮮病料PCR檢測情況；2、3：為陳舊病料PCR檢測情況；4：Marker2000

圖12

1：為DNAMarker1；2：為退火溫度為53℃；3：為退火溫度為55℃；4：為退火溫度為59℃

圖13

1：為Marker2000；2：為陰性對照；3：為組織cDNA模板量2μl；4：為組織cDNA模板量1μl；5：組織cDNA模板量0.5μl。

圖14

1：為Marker2000；2：為陰性對照；3：為血液cDNA模板量0.5μl；4：為血液cDNA模板量1μl；5：為血液cDNA模板量2μl。

圖15

1：為Marker2000；2：為精液cDNA模板量0.5μl；3：為精液cDNA模板量1μl；4：為精液cDNA模板量2μl；5；為陰性對照。

2.4 RT-PCR產物鑒定

對于目的片段與PMD-18T連接，轉化，涂板，挑菌四管，提取質粒如圖16。用DNAStar軟件對目的片段和PMD-18T的序列進行分析，對重組質粒用BamH I和Hind III經(jīng)行雙酶切鑒定。結果用BamH I 和Hind III經(jīng)行雙酶切后，得到一個大約370bp大小相片段。則說明目的片段連入PMD-18T中，結果如圖17。四個質粒都有酶切目的片段370bp，可以選一管質粒送上海生工測序。測序結果經(jīng)過比對完全符合。

圖16

1、2、3、4：依次為對應搖菌后菌液提取的質粒

圖17

1、2、3、4：依次為對應的質粒酶切；5：為對照質粒；6：為DNAMarker1。

3 討論

PRRSV侵害免疫系統(tǒng)，并能夠形成持續(xù)性感染，免疫預防比較困難，因此該病已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病。我國目前對于PRRS診斷技術有間接免疫熒光、原位雜交、免疫組化及RT-PCR等[2-3]。前幾種檢測方法耗時長、操作繁瑣，而RT-PCR具有簡單快捷、準確等優(yōu)點。RT-PCR技術的建立和應用可望為病畜和帶毒未發(fā)病的家畜的檢測提供一種更有效的新方法。

PRRS病毒可通過感染公豬的精液傳播，因此，隨著人工授精技術的普及，通過精液傳播PRRS病毒的可能性大大增加，帶有PRRS病毒的精液可能被輸送到多個豬場而大量傳播。PCR檢測公豬精液有三點值得注意，第一，必須用低速離心法將精液分為精子和非精子細胞，通過離心得到病毒分布較多的精子部分用于檢測是必要的；第二，使用的裂解緩沖液不應有還原劑。還原劑能引起精子DNA的染色質分散，從而導致錯誤的PCR陰性反應[4]。由本文模板量確定實驗可以得出，精液提取的RNA量相對較少，因此在RT-PCR中cDNA模板量可以由提取的RNA質量來粗慮。

在PCR試驗中各反應成分都會對PCR擴增產生影響，這種影響主要表現(xiàn)兩個方面，一是增加PCR產物量，二是降低PCR產物量，如增加模板、引物、RTaq酶濃度、降低退火溫度能增加PCR產量。其中，引物濃度和模板濃度對PCR產物擴增量影響較大。這些可增加PCR產物量的因素往往也增加非特異性擴增量；相反，降低引物濃度、RTaq酶濃度、升高退火溫度能減少PCR產量。dNTP濃度在低濃度時，隨著濃度增加，能增加PCR產物量，在高濃度時，能抑制PCR反應。在PCR實驗中可以充分調節(jié)這些反應成分量以最大限度地消除非特異性擴增，而增加特異性擴增，這也是進行PCR實驗的主要目的。

從本試驗PCR篩選中發(fā)現(xiàn)，dNTPs濃度太大，如達到4μmol/L時，能抑制PCR擴增[5]。另外本試驗發(fā)現(xiàn)，RT過程中42℃孵育1h就足以滿足本實驗的要求，這樣大大縮短了檢測時間，對于診斷及防制疫病有著重要的意義，同時新鮮被檢樣品要比陳舊被檢樣品RT-PCR效果好得多。從試驗中發(fā)現(xiàn)，陳舊被檢樣品提取的RNA極易降解，電泳時可看出新鮮被檢樣品提取的RNA有明顯的三條，帶形較完整。而從PCR結果我們也可以看出PCR檢測新鮮被檢樣品的特異性目的帶較亮，帶形清晰。反之，PCR檢測陳舊被檢樣品的特異性目的帶帶形模糊不易觀察。另外，試驗中提取的RNA及RNA反轉錄后的cDNA保存于-20℃大約一周(甚至更短)就會自行降解，因此在RT-PCR試驗過程中保證被檢樣品、RNA及cDNA的新鮮對于試驗效果是十分必要的。引物在PCR擴增中起著很重要的作用，優(yōu)質的引物可以保證擴增產物的特異性，避免出現(xiàn)非特異性帶。試驗結果表明，本試驗所設計的PRRSV通用型引物的設計是成功的。PCR反應時的退火溫度對其特異性也有影響，一般來說，退火溫度越高，擴增的特異性越好。退火溫度在50~55℃以上時，引物的非特異性結合已經(jīng)很低，而本試驗經(jīng)反復驗證選擇退火溫度為59℃，可以充分保證擴增的特異性。

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（2012–07–16）

國家自然科學基金(3086025)。

S858.28

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1007-1733(2012)11-0001-05