鄧 龍 尹大川 鄧 勛 宋瑞清*

(1.黑龍江省林科院，哈爾濱 150081；2.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，哈爾濱 150040)

苗木立枯病(seedlingdamping-off)又稱苗木猝倒病，由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)引起。是苗圃普遍發(fā)生、危害嚴(yán)重的苗期病害，主要發(fā)生在1～3a生苗木上，特別是出苗1月以內(nèi)、未木質(zhì)化的苗木受害最重[1]。

木霉菌(Trichodermaspp.)是自然界中資源豐富的拮抗微生物，具有抗菌譜廣、適應(yīng)性強和多機制性的特點[2]。首先,木霉菌競爭作用強,它能迅速生長,進(jìn)行營養(yǎng)和空間位點的競爭。它能產(chǎn)生揮發(fā)性或非揮發(fā)性的抗菌類次生代謝產(chǎn)物, 如木霉素、膠霉素、綠色木霉素和抗菌肽等,對多種病原菌有抑制作用；此外還具有重寄生作用,通過胞外酶破壞病原菌細(xì)胞壁，削弱病原菌的生長勢,甚至殺死病原菌。目前世界范圍內(nèi)有多個以木霉為主要成分的生物殺菌劑，在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用[3]。同時，木霉還具有促進(jìn)植物生長、提高抗逆性的作用[4]。本研究利用木霉菌株TC-14對苗木立枯病菌進(jìn)行室內(nèi)外生測，為進(jìn)一步研究木霉對苗木立枯病菌的抑菌機理并開發(fā)具有較高穩(wěn)定性的生物農(nóng)藥奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

(1)木霉菌株：菌株TC-14，保存于東北林業(yè)大學(xué)森林微生物研究中心。

(2)病原菌株：苗木立枯病菌—立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)，保存于東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林微生物研究中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株TC-14對苗木立枯病菌的抑制效果

(1)菌株對苗木立枯病菌的拮抗作用。

采用平板對峙培養(yǎng)法[5]。在PDA平板培養(yǎng)基上，相距5cm分別接種直徑0.5cm木霉菌株和病原菌株菌餅。以木霉菌株和病原菌株單獨培養(yǎng)作為對照，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每處理3次重復(fù)。每8h測量一次菌落半徑。計算被抑制率、菌絲生長速度和相對抑制效果，觀察拮抗線有無，統(tǒng)計競爭系數(shù)。

對峙培養(yǎng)中競爭系數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 菌株對峙培養(yǎng)中競爭系數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)

被抑制率(%)=(對照菌落直徑-對峙培養(yǎng)菌落直徑)/對照菌落直徑×100%

相對抑制效果=病原菌株被抑制率/拮抗菌株被抑制率

(2)非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對立枯病菌的抑制作用。

非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物制備：無菌條件下，用0.5cm打孔器切取PDA平板培養(yǎng)基上生長3d的木霉菌落，接種到在300mL PD培養(yǎng)基中，每瓶3片。恒溫振蕩培養(yǎng)(25℃，150r/min)7d。8層紗布過濾后，取濾液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到原體積的1/10，備用。

抑菌活性測定：采用生長速率法。將非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物添加到PDA培養(yǎng)基中，搖勻，使終濃度達(dá)到20%，倒平板，待冷卻凝固后，接入病原菌，以不添加代謝產(chǎn)物的PDA平板培養(yǎng)作為對照，25℃恒溫培養(yǎng)5d。采用十字交叉法測量病原菌的菌落直徑，計算木霉非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對病原菌生長的抑制率，每處理3次重復(fù)。

1.2.2 木霉菌株TC-14野外應(yīng)用研究

試驗地位于黑龍江省葦河林業(yè)局西林林場苗圃，供試苗木為落葉松1a生苗木。

TC-14防治菌劑采用濃度為3.5×109/mL的孢子懸浮液和發(fā)酵液原液，分別設(shè)置4個濃度梯度，以空白作為對照，采用灌根法進(jìn)行防治。每個處理1個苗床(1m×20m)，2個重復(fù)。2011年5月5日和2011年5月20日防治2次。防治30d后(6月20日)調(diào)查防治效果以及苗木株高。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌株TC-14對立枯病菌的抑制效果

2.1.1 拮抗效果

對峙培養(yǎng)48h后，菌株TC-14對3種立枯病菌生長的相對抑制效果均超過1(表2，圖1)。木霉菌株生長速度快，競爭系數(shù)高，在同苗木立枯病菌的對峙培養(yǎng)中，迅速占領(lǐng)生態(tài)位，最終覆蓋病原菌或形成較為明顯的拮抗線，病原菌在木霉菌的作用下幾乎停止生長，并最終被木霉菌所覆蓋。

表2 木霉菌株TC-14對苗木立枯病菌的抑制效果

2.1.2 次生代謝產(chǎn)物抑菌效果

TC-14次生代謝產(chǎn)物對3個病原菌株均有一定的抑制效果(表2，圖2)。其中，對立枯絲核菌的抑菌率最高，為89.26%。病原菌在平板上菌絲稀疏，生長明顯變?nèi)跎踔敛簧L。該結(jié)果與前面的對峙實驗結(jié)果相吻合。

2.2 木霉菌株TC-14的野外應(yīng)用效果

利用木霉菌株TC-14制作的菌劑(孢子粉劑和液體菌劑)對苗木立枯病具有顯著的控制效果(表3)，各菌劑防治效果均接近或高于80%。不同濃度梯度菌劑的防治效果存在一定的差異。孢子粉劑防治效果高于液體菌劑。TC-14孢子粉劑10倍液對苗木立枯病防治效果達(dá)到88.6%。

表3 木霉菌劑野外防治效果

木霉菌株TC-14孢子懸浮液和液體菌劑對落葉松苗木的生長均有不同程度的促進(jìn)作用(圖3)。灌根30d后，液體菌劑10倍液對落葉松苗木高生長促進(jìn)效果最高，與對照相比高生長提高30.2%。兩種劑型的50倍液對苗木生長均表現(xiàn)出抑制。

3 結(jié)論

通過木霉菌株TC-14對苗木立枯病菌的室內(nèi)外生物測定結(jié)果，得出以下結(jié)論：菌株TC-14對立枯病菌有一定的拮抗作用，非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物中含有高效抑菌活性成分，對立枯病菌具有明顯的控制效果。TC-14孢子懸浮液10倍液野外防治效果最好，液體菌劑10倍液對落葉松苗木高生長促進(jìn)效果顯著。

參考文獻(xiàn)：

[1]馬存世,劉正祥.針葉苗木立枯病綜合防治技術(shù)[J].甘肅科技，2006，22(9)：221～222.

[2]朱廷恒，邢小平，孫順娣.木霉T97菌株對幾種植物病原真菌的拮抗作用機制和溫室防治試驗[J].植物保護(hù)學(xué)報，2004,31(2)：139～144.

[3]Francesco V., Krishnapillai S., Emilio L. Trichoderma-plant-pathogen interactions[J].Soil Biology & Biochemistry,2008,(40):1～10.

[4]F. Vinale, K. Sivasithamparamb. A novel role for Trichoderma secondary metabolites in the interactions with plants[J].Physiological and Molecular Plant Pathology,2008，(72):80～86.

[5]Morton, D.T., Stroube, N.H. Antagonistic and stimulatory eVects of microorganisms upon Sclerotium rolfsii[J].Phytopathology,1955,(45):419～420.

[6]宋漳，陳輝.綠色木霉對土傳病原真菌的體外拮抗作用[J].福建林學(xué)院學(xué)報,2002,22(3):219～222.