初建青，王文艷，房經(jīng)貴*，張春華，張彥平，宋長年

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京210095;2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，江蘇南京210014)

葡萄是世界性的主要水果，也是我國栽培的主要落葉果樹之一。施肥是葡萄生產(chǎn)中重要的農(nóng)事操作，葡萄施肥時間的選擇往往都是根據(jù)作物的生長情況或物候期，是一種經(jīng)驗性的操作，難以做到指導(dǎo)當(dāng)年精確施肥的水平。這不僅沒有達到施肥的最佳效果，而且造成肥料的浪費以及由此引起的環(huán)境污染。另外，由于不同年份環(huán)境與氣候等外界因素的差異，當(dāng)年的調(diào)查信息用于來年的田間管理也是不夠理想與科學(xué)的。傳統(tǒng)的理論已經(jīng)難以促進施肥、灌溉等重要農(nóng)業(yè)技術(shù)產(chǎn)生質(zhì)的提高?，F(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)為人們利用基因信息指導(dǎo)施肥提供了可能，正如Boss等［1］早在2000年就預(yù)測在將來的20年里對葡萄基因以及基因功能的認(rèn)識將加快通過基因工程手段對葡萄結(jié)果能力、果實成熟期以及植株生長習(xí)性等進行更有效調(diào)控時期的到來。葡萄全基因的測序更是為葡萄分子生物學(xué)的研究提供了重要條件［2－3］。

氮是葡萄重要的營養(yǎng)元素，氮素進入植物體后的代謝是一個相當(dāng)重要的生理過程，它直接影響到作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。而硝酸鹽還原酶(Nitrate reductase，NR)，亞硝酸還原酶 (Nitrite reductase，NiR)，谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase，GS)，谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase，GDH)和天冬酰胺合成酶(Asparagine synthetase，AS)等氮代謝關(guān)鍵酶在氮的同化過程中起著不可或缺的作用［4－7］，不同作物品種、同一種作物不同器官組織中有關(guān)酶的活性對于氮用量、施用時間等均呈現(xiàn)一定的反應(yīng)［5，8－10］。葉面施肥對葡萄產(chǎn)量、品質(zhì)及生理方面的作用已有諸多研究［11－14］，但尚無葡萄葉面噴肥對氮代謝循環(huán)關(guān)鍵酶基因表達影響的報道。根據(jù)實際生產(chǎn)與研究需要，本實驗分離和克隆了氮代謝循環(huán)途徑中上述5個關(guān)鍵酶對應(yīng)基因(GS，GDH，AS，NR和NiR)的編碼序列，對他們進行了亞細(xì)胞定位，并利用半定量RT-PCR和熒光定量PCR法研究了葉面施氮對氮代謝相關(guān)基因表達的影響，為進一步研究葡萄氮代謝機制以及提高葡萄葉面施肥效果提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗設(shè)計 試材取自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦試驗基地，選用6年生藤稔葡萄(V.vinifera×V.labrusca Fujiminori)，樹勢良好，果園實施常規(guī)水平管理。在葡萄開花前期(5月14日)上午9時以尿素(山西豐喜華瑞煤化工有限公司生產(chǎn))作為葉面肥，設(shè)置對照(噴清水)、0.3%、0.5%、0.7%(質(zhì)量比)4個濃度處理，每個處理噴施5株，試驗設(shè)置3次重復(fù)。分別于處理后6、24、48 h采集葉片，幼葉采自15個節(jié)位長枝條上的第12、13節(jié)位，老葉采自15個節(jié)位長枝條上的第3、4節(jié)位，－40℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 質(zhì)粒、菌株和試劑 大腸桿菌(Escherichia coli)菌株DH5α由本實驗室保存。亞細(xì)胞定位載體pJIT166－GFP由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與育種國家重點實驗室惠贈。PowerScriptTMII反轉(zhuǎn)錄酶購自Clontech公司，DNase酶Ⅰ、Ex Taq酶、pMD18－T simple載體、dNTP、DNA Marker、HindⅢ、BamHⅠ、SalⅠ和XbaⅠ購自TaKaRa公司，Trizol Reagent購自Invitrogen公司，T4 DNA連接酶購自Promega公司，DNA回收試劑盒、DL 2000 Plus DNA Marker為北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。所用引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司(Invitrogen)合成(表1)。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同處理對葡萄品質(zhì)指標(biāo)的影響 于果實成熟后每株葡萄隨機取5個果穗測其平均單果重(g)和平均果實大小(cm2)。其中，平均果實大小(cm2)=縱經(jīng)×橫經(jīng)。

1.2.2 RNA的提取與純化 葡萄葉片總RNA的提取、消化參照張彥蘋［16］和 Chang［17］的方法。mRNA的純化采用Promega公司生產(chǎn)的PloyATtract?mRNA Isolation System IV試劑盒進行。

1.2.3 cDNA第一鏈合成 以mRNA為模板，引物P01反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，引物P02延伸加帽子，空氣加熱條件下42℃保溫1 h，75℃保溫10 min，冰上冷卻2 min后，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 基因ORF及3'末端的擴增 根據(jù)不同物種間同源基因的核酸序列相對保守的特點，在Gen-Bank的核酸(nr/nt)數(shù)據(jù)庫中檢索擬南芥的GDH基因序列145358164，NR基因序列30681919，NiR基因序列30699283，GS基因序列186531753和AS基因序列145339205，并分別以以上序列為探針對葡萄屬EST數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索，得到多條與之高度同源的葡萄 EST序列;將獲得的 EST序列用DNAStar軟件進行首尾拼接，獲得新的Contig;以獲得的 Contig反復(fù)對葡萄 EST公共數(shù)據(jù)庫進行BLAST檢索、拼接，盡可能獲得全長cDNA［18］。以cDNA為模板分別利用氮素代謝循環(huán)途徑中的5個關(guān)鍵酶基因GDH、NiR、NR、GS、AS的上游引物和下游引物(表1)進行PCR擴增獲得各基因的ORF區(qū)，反應(yīng)體系為 50 μL:cDNA 2 μL，10 pmol/μL 的引物各1 μL，10 × Ex Buffer 5 μL，2.5 mmol/L 的 dNTP Mixture 5 μL，Ex Taq 酶0.25 μL，用滅菌純水補足到50 μL。反應(yīng)參數(shù)為 94℃ 預(yù)變性 5min，94℃ 45 s、Tm 45 s、72℃1 min、35個循環(huán)，72℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目標(biāo)片段進行TA克隆，由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成測序。

1.2.5 亞細(xì)胞定位分析 分別以表1中含酶切位點的引物(用Primer Premier 5設(shè)計能擴增包含整個ORF，但去除終止密碼子)擴增GDH、NiR、NR、GS、AS基因，并克隆提取質(zhì)粒，分別經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ、SalⅠ和 BamHⅠ、HindⅢ和 SalⅠ、HindⅢ和XbaⅠ、HindⅢ和XbaⅠ、HindⅢ和SalⅠ、HindⅢ和SalⅠ雙酶切，用T4 DNA連接酶連接到pJIT166－GFP載體，得到 GFP/基因融合表達載體，轉(zhuǎn)入DH5α，PCR、酶切篩選陽性克隆，并對陽性克隆進行測序驗證［19］。微粒子彈的制備和受體材料的轟擊方法參照已有研究報道［19－20］。轟擊后的洋蔥表皮細(xì)胞25℃暗培養(yǎng)24 h后制片，于激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP2)下觀察細(xì)胞中的熒光。將轉(zhuǎn)化后的洋蔥表皮用20%蔗糖進行質(zhì)壁分離處理后，再分別用藍光(395 nm)和紫外光激發(fā)成像，選用B(IF2490)激發(fā)濾光器，用PM230全自動顯微照相裝置拍照［19］。

1.2.6 半定量RT-PCR 為明確葡萄葉面噴施尿素對5個基因的表達的影響，利用尿素處理后老葉和幼葉的cDNA作為PCR模板，以葡萄中的UBI基因為內(nèi)參，進行半定量RT-PCR，為確保半定量 RTPCR的特異性，引物設(shè)計在每個基因的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)，目的基因的引物未跨內(nèi)含子(表1)。反應(yīng)條件為:94℃變性3 min后進入循環(huán)，94℃變性30 s，Tm 退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，共 28 個循環(huán)后，72℃終延伸5 min。UBI反應(yīng)程序條件與擴增目的基因的條件相同。

1.2.7 熒光定量PCR 參照已有研究報道［18，21］，分別取2 μg RNA以P01和P02引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，葡萄看家基因UBI為內(nèi)參進行定量PCR，目的基因的引物及片段大小見表1。應(yīng)用Bio-Rad My-IQ 2熒光定量PCR儀進行實時定量。RCR的反應(yīng)體系按SYBR GreenⅠ(TOYOBO)說明書進行。反應(yīng)程序為95℃ 10 s預(yù)變性，然后以95℃ 變性10 s、Tm退火20 s，72℃延伸30 s，進行40個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線以及熔解曲線。試驗設(shè)3次重復(fù)，試驗數(shù)據(jù)采用LinRegPCR和Excel軟件，進行相對定量法分析［22］，通過比較在不同組織待測基因與UBI基因表達量的比值，直觀地顯示出待測基因相對含量的變化。

2 結(jié)果分析

2.1 葉面噴施不同濃度尿素對葡萄單粒重、單穗重、果實大小及葉片生長情況的影響

從表2看出，0.3%、0.5%、0.7%3種不同濃度尿素水平的處理均顯著提高了藤稔葡萄的單粒重，與對照相比，分別提高了49.50%、39.50%、24.70%，其中0.3%濃度尿素的處理對單粒重的影響最為明顯;0.3%、0.5%、0.7%3種不同濃度尿素水平的處理均對藤稔葡萄的果實大小有一定的效果，分別比對照提高了36.4%、27.9%、26.9%，0.3%濃度尿素的處理對果實大小的影響最為明顯;與對照相比，0.3%、0.5%、0.7%3種不同濃度尿素水平的處理對藤稔葡萄單穗重的影響均達到顯著水平，分別提高了 85.83、79.70、39.64 g，其中0.7%濃度尿素的處理效果最不明顯，說明中尿素水平有顯著增大單粒重、果實大小及單穗重的作用，濃度過高反而效果不顯著。

從圖1看出，三個處理的葉片呈現(xiàn)較深的綠色，說明葉面噴施尿素有葉片生長的作用。但是，0.7%尿素處理的葉片上出現(xiàn)枯黃葉緣和分布規(guī)律枯黃斑點，這可能是噴施尿素濃度偏高造成的葉面燒灼。

表2 葉面噴施尿素對葡萄單粒重、果實大小及單穗重的影響Table 2 Effect of foliar applied urea on fruit biology character of fruit of Tengren grape

2.2 相關(guān)基因ORF區(qū)的克隆

以cDNA為模板分別利用GDH、NiR、NR、GS、AS 5個基因的上游引物和下游引物(未跨內(nèi)含子見表1)進行PCR擴增獲得各基因的ORF，得到大小與預(yù)期目標(biāo)片段長度一致的相應(yīng)條帶(圖2)。切膠回收純化各個片段，以pMD18－T simple為載體對回收片段進行克隆。在選擇培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)上挑取單菌落，經(jīng)PCR鑒定，獲得了陽性克隆。測序的結(jié)果表明，特異擴增產(chǎn)物的實際大小見表1，包含上下游引物序列，將所獲得序列在NCBI上登錄，登錄號見表1。

2.3 5個基因的亞細(xì)胞定位

細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成后需要被轉(zhuǎn)運到特定的細(xì)胞器中，只有轉(zhuǎn)運到正確的部位才能參與細(xì)胞的各種生命活動［23］。為進一步認(rèn)識所克隆的GDH、NiR、NR、GS、AS基因表達的蛋白在細(xì)胞中發(fā)揮功能的具體部位，本研究對其進行了亞細(xì)胞定位分析(圖3)。本試驗在綠色熒光蛋白與基因的融合基因表達載體構(gòu)建完成后，對載體目標(biāo)區(qū)域的測序結(jié)果表明融合基因載體構(gòu)建正確［19］，之后利用基因槍法將綠色熒光蛋白(GFP)基因轉(zhuǎn)化到洋蔥表皮細(xì)胞中，獲得高效瞬時表達，綠色熒光蛋白在475 nm藍光激發(fā)下產(chǎn)生509 nm的綠色熒光。對照GFP蛋白無核定位功能，可經(jīng)過核孔復(fù)合物擴散進入細(xì)胞核，從而在細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)中都可以觀察到清晰的GFP的綠色熒光信號(圖3F)。本研究將 GDH、NiR、NR、GS、AS基因插入到35S啟動子和綠色熒光蛋白基因之間形成GDH-GFP、NiR-GFP、NR-GFP、GSGFP、AS-GFP融合蛋白，其中GDH-GFP在線粒體內(nèi)產(chǎn)生綠色熒光(圖3A)，NR-GFP在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生綠色熒光(圖3B)，AS-GFP在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生綠色熒光(圖3C)，而 NiR-GFP(圖3D)和 GS-GFP(圖3-E)在細(xì)胞內(nèi)未產(chǎn)生綠色熒光，這可能是由于NiR-GFP和GS-GFP未表達，也有可能NiR-GFP和GS-GFP具有在葉綠體內(nèi)表達的特點而無法在沒有葉綠體的洋蔥細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生信號，故檢測不到定位信息。

2.4 相關(guān)基因的時空表達分析

2.4.1 基因特異引物的PCR驗證 為避免qRTPCR結(jié)果的假陽性的影響，本研究分別利用5個基因的上、下游引物(表1)分別對部分取樣時期來源底物cDNA進行PCR擴增，特異擴增產(chǎn)物回收、克隆、測序得到與預(yù)期PCR產(chǎn)物相符，并且RNA提取和消化過程嚴(yán)格地消除了DNA污染，說明引物設(shè)計和反應(yīng)模板質(zhì)量均符合半定量RT-PCR、熒光定量PCR的實驗要求，不存在假陽性現(xiàn)象。

圖3 GDH、NR、AS、NiR、GS基因在洋蔥表皮細(xì)胞中的定位Fig.3 Subcellular localization of GDH，NR，AS，NiR，GS-GFP fusion protein in onion epidermal cells

2.4.2 葉面噴施不同濃度尿素對葡萄硝酸還原酶基因表達的影響 硝酸還原酶(NR)是植物氮代謝的限速酶，其基因表達高低控制著整個同化過程，且反映了蛋白質(zhì)合成和氮代謝的活性。NR活性受到很多環(huán)境因子調(diào)節(jié)，如氮源、光、O2/CO2、pH和溫度，還有些內(nèi)在因素如代謝物和植物激素。結(jié)果表明，葡萄硝酸還原酶基因(NR)的表達水平隨著葉面噴施尿素濃度的不同而表現(xiàn)出明顯的差異，在同一時間段下，表達水平在0.3%和0.5%濃度的處理下顯著高于CK和0.7%濃度的處理(圖4)，說明中尿素濃度有利于NR的表達，而高尿素濃度不利于NR的表達;葡萄老葉NR在0.5%濃度的處理下表達水平顯著，幼葉NR在0.3%濃度的處理下表達水平顯著，說明葡萄老葉以噴施0.5%濃度的尿素對NR的表達水平影響顯著，幼葉以噴施0.3%濃度的尿素對NR的表達水平影響顯著。在同一濃度尿素水平下，NR在不同時間段的表達水平差異不一致:葡萄老葉NR在處理后48 h的表達水平顯著高于6 h和24 h，幼葉NR在處理后6 h的表達水平顯著高于24 h和48 h，說明葡萄幼葉NR對葉面噴施尿素的響應(yīng)要早于老葉。在同一濃度尿素水平和同一時間段下，NR在葡萄幼葉中的表達水平顯著高于老葉，說明葉面噴施尿素以噴布到幼葉對NR的表達水平影響顯著。NR在葡萄葉片噴施尿素后直至48 h一直保持著比較高的表達水平，因此其可以作為葡萄葉片噴施尿素中后期的氮代謝信號途徑的標(biāo)記基因。

圖4 葉面噴施尿素對葡萄硝酸還原酶(NR)基因表達的影響Fig.4 Effect of foliar applied urea on expression of genes encoding nitrate reductase(NR)in grape leaves

2.4.3 葉面噴施不同濃度尿素對葡萄亞硝酸還原酶基因表達的影響 葡萄亞硝酸還原酶(NiR)是硝酸鹽同化途徑中第二個發(fā)揮作用的酶，反應(yīng)涉及從降解的鐵氧還蛋白向亞硝酸鹽轉(zhuǎn)移6個電子，使之形成銨。圖5看出，在同一時間段下，NiR的表達水平在0.3%和0.5%濃度的處理下顯著高于CK和0.7%濃度的處理;在同一濃度尿素水平和同一時間段下，葡萄幼葉NiR的表達水平顯著高于老葉;在同一濃度尿素水平下，NiR在不同時間段的表達水平差異不一致:葡萄老葉NiR在處理后24 h的表達水平顯著高于6 h和24 h，幼葉NiR在處理后6 h的表達水平顯著高于24 h和48 h。與NR表達水平相比(圖4)，NiR在各個濃度水平和各個時間段下的表達水平均低于NR，說明葡萄葉面噴施尿素后NiR對信號的響應(yīng)效果不如NR顯著，可能是由于NiR位于NR催化反應(yīng)的下游，對信號的響應(yīng)比較置后。

2.4.4 葉面噴施不同濃度尿素對葡萄谷氨酰胺合成酶基因表達的影響 葡萄谷氨酰胺合成酶(GS)是處于氮代謝中心的多功能酶，催化無機氮轉(zhuǎn)變成有機氮的第一步反應(yīng)，其基因表達的高低可以反映氮素同化能力的強弱。圖6看出，在同一濃度尿素水平下，GS各個時間段的表達水平在老葉和幼葉之間存在顯著差異，幼葉GS的表達水平明顯高于老葉;NR在不同時間段的表達水平差異亦不一致:葡萄老葉NR和幼葉NR均在處理后6 h的表達水平顯著高于24 h和48 h。在各個時間段下，GS的表達水平均在0.3%和0.5%濃度的處理下顯著高于CK和0.7%濃度的處理。葡萄葉片噴施尿素后6 h時GS的表達量上升明顯，其表達水平明顯要高于其他基因，因此GS基因可以作為葡萄葉片噴施尿素前期的氮代謝信號途徑的標(biāo)記基因。

2.4.5 葉面噴施不同濃度尿素對葡萄天冬酰胺合成酶基因表達的影響 Nakano等［24］通過Northern雜交分析表明天冬酰胺合成酶基因(AS)在同一水稻植株不同組織中的表達水平不同，在同一組織不同發(fā)育時期的表達水平也不同。圖7看出，在同一濃度尿素水平和同一時間段下，葡萄AS在幼葉中的表達水平明顯高于老葉，說明噴施尿素以噴布到幼葉對AS的表達影響顯著。在同一濃度尿素水平下，AS在不同時間段的表達水平差異不一致:葡萄老葉NR在處理后48 h的表達水平顯著高于6 h和24 h，幼葉NR在處理后6 h的表達水平顯著高于24 h和48 h。AS的表達水平隨著葉面噴施尿素濃度的不同而表現(xiàn)出明顯的差異，在同一時間段下，老葉AS表達水平趨勢為U0.3% ＞U0.5% ＞U0.7% ＞CK，幼葉AS表達水平趨勢為U0.5%＞U0.3%＞U0.7%＞CK，但幼葉AS在6h的表達水平CK＞0.7%，這可能由于不同采樣時間以及采樣時的光照、氣溫、濕度等環(huán)境因素的影響而導(dǎo)致的表達趨勢不一致。與GS表達水平相比(圖6)，AS在各個濃度水平和各個時間段下的表達水平均低于GS，說明葡萄葉面噴施尿素后AS對信號的響應(yīng)效果不如GS顯著，可能是由于AS位于GS催化反應(yīng)的下游，對信號的響應(yīng)比較滯后。

圖7 葉面噴施尿素對葡萄天冬酰胺合成酶(AS)基因表達的影響Fig.7 Effect of foliar applied urea on expression of genes encoding asparagine synthetase(AS)in grape leaves

2.4.6 葉面噴施不同濃度尿素對葡萄谷氨酸脫氫酶基因表達的影響 谷氨酸脫氫酶(GDH)一般參與氨基酸降解的氧化脫氧作用，在植物生育期內(nèi)，GDH在氨的再同化中起重要作用，尤其是在果實發(fā)育后期對于催化形成谷氨酸具有重要作用。試驗結(jié)果(圖8)表明，噴施尿素的濃度不同，基因的表達水平存在一定差異，在同一時間段下以0.3%和0.5%濃度的處理對谷氨酸脫氫酶基因(GDH)表達的影響更為明顯，說明葉面噴施中濃度尿素更能夠誘導(dǎo)氮代謝循環(huán)中的GDH發(fā)揮作用。GDH的表達水平在0.7%濃度的處理下不如0.3%和0.5%濃度的處理顯著，可能是由于濃度過高對葡萄生長造成不利的影響。通過比較噴施同一濃度尿素后同一時間段葡萄老葉和幼葉中GDH的表達水平看出，幼葉GDH的表達水平總體上比老葉中的大，說明葉面噴施尿素以噴布到幼葉或新稍對葡萄GDH的表達水平影響更大。GDH在不同時間段的表達水平差異不一致，葡萄老葉中GDH的表達水平在葉面噴施尿素后48 h達到最高，老葉中GDH的表達水平在葉面噴施尿素后6 h達到最高。

3 討論

圖8 葉面噴施尿素對葡萄谷氨酸脫氫酶(GDH)基因表達的影響Fig.8 Effect of foliar applied urea on expression of genes encoding glutamate dehydrogenase(GDH)in grape leaves

氮是植物的重要成分，對植物生長有著重要的作用。特別是葉片氮含量與光合作用之間有著高度正相關(guān)關(guān)系［25－26］。有關(guān)氮肥施用量對植物生長及產(chǎn)量的影響已有許多報道［27－34］。本試驗中葡萄葉片的顏色隨著葉面噴施尿素濃度的增加而呈增深的趨勢(圖1)，說明葡萄葉面噴施尿素有利于葉片生長。楊陽等［35］的研究成果表明，所有噴氮處理均有利于提高葡萄果實的單粒重。單一葉面肥或不同組合的葉面肥均顯著提高了葡萄的單穗重，使果粒明顯增大，最終提高了葡萄的產(chǎn)量，增產(chǎn)率高達12.75% ～24.57%［36］。葉面噴施尿素后，藤稔葡萄的單粒重和果實大小明顯高于對照(表2)，說明葉面噴施尿素有利于提高葡萄果實的單粒重和果實大小。

大量的研究顯示，由于半定量RT-PCR與熒光定量PCR兩者的基本原理的一致性，兩者的結(jié)果存在高度一致性［18，21］。本研究采用半定量 RT-PCR與熒光定量PCR方法對葡萄5個氮代謝相關(guān)重要基因表達特性的研究表明，兩者的結(jié)果一致性比較高，說明了所利用的RT-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定與可靠。本實驗通過噴施尿素后老葉和幼葉的基因表達情況比較得出，幼葉中同一濃度各個時間段的基因變化總體上比老葉中的大，可能是吸收的尿素優(yōu)先分配到新梢和嫩葉等新生器官中，而向下僅有少量的運輸，說明葉面噴施尿素以噴布到幼葉或新稍對基因表達的影響效果更佳，這與孫培琪［8］在櫻桃上的研究結(jié)果是一致的。噴施尿素后48 h時，幼葉中各個基因的表達水平明顯高于老葉，說明了幼葉中肥效的持續(xù)時間可能要長于老葉。本研究噴施不同濃度尿素后基因的表達量總體上比對照有明顯變化，其中0.3%和0.5%濃度處理的效果比0.7%濃度處理的效果顯著，說明葉面適量噴施尿素可以誘導(dǎo)氮代謝循環(huán)中的關(guān)鍵酶發(fā)揮作用，并對氮同化有顯著效果;而0.3%和0.5%濃度的尿素對藤稔葡萄單粒重、單穗重、果實大小以及葉片生長情況比0.7%濃度處理的效果顯著(表1)，顯然噴施不同濃度尿素后基因的響應(yīng)情況與果實的生長情況同步增長，說明了0.3%和0.5%濃度的尿素適宜于葡萄葉面噴施。

不同植物達到穩(wěn)定吸收速率的誘導(dǎo)時間不同。小麥的最大吸收能力是在誘導(dǎo)10 h后達到，而玉米6 h，大麥 12 ～24 h［37］，不同植物關(guān)閉這一誘導(dǎo)系統(tǒng)所需的時間也不相同。從圖4～圖8可以看出，本研究中通過半定量RT-PCR與熒光定量PCR檢測噴施尿素后葉片中基因的表達情況，6 h時5個基因的表達量均高于對照，說明葉片在噴施尿素后6 h時已經(jīng)開始活躍的氮同化代謝，氮素代謝循環(huán)中的關(guān)鍵酶已經(jīng)發(fā)揮作用，直至48 h時5個基因的表達量仍高于對照，說明此時相關(guān)代謝仍比較活躍，也說明了葉面噴施尿素的肥效至少可以持續(xù)48 h。而對于噴施尿素后各個基因在6、24和48 h的表達水平出現(xiàn)一定的不一致性，可能是由于光照、氣溫、濕度等環(huán)境因素影響了酶的活性以致表達量出現(xiàn)一定的非規(guī)律差異，但具體的原因還需進一步研究。

胞質(zhì)中的尿素經(jīng)脲酶水解為氨，進而在谷氨酰胺合成酶(GS)的作用下進入氮同化途徑，而外源氮源如尿素也可以誘導(dǎo)另一條調(diào)控途徑促進NR基因及NiR基因的轉(zhuǎn)錄水平提高［38－39］。從本實驗的表達分析結(jié)果可知葉面噴施尿素后GS以及其下游基因AS和GDH的表達量均比對照有明顯增高。雖然GS的上游基因NR及NiR的表達量也有增高的趨勢，但它們的表達量在葉面噴施尿素后6 h低于GS、AS，說明葉面噴施尿素可能誘導(dǎo)了另一條調(diào)控途徑，從而促進了NR及NiR的表達，但此調(diào)控途徑對信號的響應(yīng)效果不如在谷氨酰胺合成酶(GS)的作用下進入氮同化的途徑明顯。NR、GS在各個階段的表達水平分別高于NiR、AS，說明葡萄葉面噴施尿素后NR、GS對信號的響應(yīng)效果分別比NiR、AS顯著，可能是因為氮代謝循環(huán)途徑中NR、GS分別位于NiR、AS催化反應(yīng)的上游，對信號的響應(yīng)比較早。

Wan等［40］的研究表明，AS1表達的水平可以作為大豆育種中篩選高(或低)蛋白質(zhì)含量種質(zhì)的一個標(biāo)記。氮代謝關(guān)鍵酶調(diào)控基因也具有信號途徑標(biāo)記基因的特點，對于分析不同植物氮代謝信號途徑具有重要幫助。本實驗的表達分析結(jié)果看出，葡萄葉片噴施尿素后6 h時GS的表達量上升明顯，其表達水平明顯要高于其他基因，因此GS基因可以作為葡萄葉片噴施尿素前期的氮代謝信號途徑的標(biāo)記基因。許多研究表明，硝酸還原酶是高等植物氮素同化的限速酶［41］，也是一種誘導(dǎo)酶［42］，而 NR 基因在葡萄葉片噴施尿素后直至48 h一直保持著比較高的表達水平，與前人研究結(jié)果相一致［39］，因此其可以作為葡萄葉片噴施尿素中后期的氮代謝信號途徑的標(biāo)記基因。

4 結(jié)論

統(tǒng)計分析結(jié)果表明，中尿素水平的葉面噴肥有顯著增大藤稔葡萄單粒重、果實大小及單穗重的作用，濃度過高反而效果不顯著。對葡萄5個氮代謝相關(guān)基因的亞細(xì)胞定位及表達情況的研究結(jié)果表明，GDH-GFP定位于線粒體，NR-GFP定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，AS-GFP定位于細(xì)胞質(zhì)，而 NiR-GFP和GS-GFP在細(xì)胞內(nèi)未產(chǎn)生綠色熒光。5個基因在葡萄幼葉中的表達水平顯著高于老葉;在不同時間段的表達水平差異不一致，但表達水平均高于對照，其中以0.3%和0.5%濃度處理的效果最明顯。噴施尿素后6 h，GS的表達量上升幅度明顯高于其它基因，而NR在噴施尿素后48 h內(nèi)一直保持著比較高的表達水平;NiR、AS表達量的變化趨勢分別與NR、GS相一致，并且NR＞NiR，GS＞AS。

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