邢承華，吳韶輝，梅 忠，陳 雪，羅小會

(1金華職業(yè)技術學院農業(yè)與生物工程學院，浙江金華321007;2浙江省柑橘研究所，浙江臺州318020)

干旱是制約農業(yè)發(fā)展的主要因素之一，我國干旱、半干旱地區(qū)面積約占全國耕地總面積的一半。植物對干旱的響應，主要通過根系進行。根系既是植物吸收水分和養(yǎng)分的主要器官，也是最早感受土壤干旱的器官。在干旱脅迫條件下，根系的生理代謝對于農作物抗旱性有重要意義［1］。

根邊緣細胞(root border cells，RBCs)，也稱脫落的根冠細胞(sloughed root cap cells)，是從根冠表皮分離并聚集在根尖周圍的特殊細胞群。原位以及從根冠脫落后的RBCs，均會向周圍分泌一系列化學物質，主要成分有多糖、小分子蛋白和其它高分子有機物，包裹在RBCs的外側，這些胞外分泌物與RBCs一起覆蓋在根分生組織和根冠表面，或是土壤顆粒表面，形成一層套膜結構，對形成根際土壤團聚體［2］、提高土壤水分和養(yǎng)分的有效性［3］、影響毒害離子的遷移和生物有效性等有重要作用［4］。以往對邊緣細胞功能的研究，主要側重于對鋁毒害［5－8］、病原真菌［9］、病原細菌［10-11］和線蟲［12］的防御作用。根系也可通過增加RBCs的脫落和根冠黏液分泌以減少與土壤的摩擦［4］。在干旱脅迫條件下，水稻根外皮層邊緣厚壁細胞明顯加厚，有效防止水分喪失，保護根組織免受干旱的傷害［13］。然而對于干旱脅迫下，RBCs的脫落和其黏液分泌的變化如何調節(jié)根際微生態(tài)環(huán)境，以及如何影響根系生理特性，均需要深入探討。

黑豆屬豆科作物，為一年生草本植物，其富含礦物質和粗蛋白，作為一種主要的農作物被廣泛種植。黑豆根系產生的RBCs有著特殊的生理活性，對根際微環(huán)境的影響有著重要的生物學意義。本研究通過分析RBCs數(shù)量和黏液分泌對干旱脅迫的響應、根尖有RBCs附著和移除條件下的根相對伸長率以及根系生理特性的變化，探討干旱脅迫下RBCs發(fā)育和黏液分泌對根際微生態(tài)的作用，為RBCs抗旱機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及其培養(yǎng)

黑豆［Glycine max(L.)Merrill］種子先用雙蒸水浸泡4 h，后轉移至鋪有濕潤濾紙的搪磁盤上，置于黑暗25℃、濕度90%的人工智能氣候培養(yǎng)箱中，萌發(fā)12 h。挑選剛露白的種子分兩種方式培養(yǎng)。第一組為靜置培養(yǎng)，以保留根尖RBCs及黏液，即將露白種子播在底部墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，定量噴灑不同濃度的聚乙二醇(PEG)處理液，再蓋一張噴有同濃度PEG溶液的濾紙。干旱脅迫設3個水平:11%和22%PEG溶液，以蒸餾水(H2O)作對照。水勢分別為 －0.4 MPa、－ 1.3 MPa，PEG 以 PE-6000［14］形式供應。每隔2 h噴一次PEG處理液，1 d共噴12次。不同處理每次所噴的PEG處理液量均相同。第二組為振蕩培養(yǎng)，目的是移除根尖的RBCs及其黏液［15］。露白種子放在內裝100 mL 11%和22%PEG處理液的培養(yǎng)皿中，并蓋上保鮮膜，薄膜上用針尖扎若干個小孔利于空氣進出，培養(yǎng)條件同第一組，于水浴恒溫振蕩器中進行振蕩培養(yǎng)，每隔4 h更換處理液。黑豆于靜置培養(yǎng)后的24 h和36 h收集并統(tǒng)計RBCs數(shù)目，測定RBCs分泌的黏液厚度。靜置培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)24 h和36 h的黑豆幼苗測定根相對伸長率、脯氨酸含量、相對電導率和丙二醛(MDA)含量。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 RBCs的數(shù)目 靜置培養(yǎng)的大豆經過干旱脅迫處理24 h和36 h后，每處理均取3 mm長的根尖10個，放入裝有1.0 mL蒸餾水的離心管中，用吸管輕輕吹打1～2 min，使RBCs在水中充分展開。吸取20 μL含RBCs的懸浮液，滴于干凈的載玻片上，并蓋上蓋玻片，在顯微鏡下統(tǒng)計RBCs數(shù)目。5次重復，計算1.0 mL蒸餾水中所含RBCs的數(shù)目，并換算為一個根尖的RBCs總數(shù)。

1.2.2 RBCs黏液厚度 剪取10 mm長的根尖，在墨水∶0.2%果膠酶為1∶1(V/V)的染色液中輕輕攪動15～30 s，洗脫根尖RBCs，制成臨時裝片，用顯微鏡(Motic BA400 EF－UPR)鏡檢并拍照。用LEICA QWIN軟件分別測量每個RBCs黏液層厚度差異較大的10處，每處理測量10個 RBCs，計算 10個RBCs黏液厚度的平均值。

1.2.3 根相對伸長率 先測定處理前黑豆的初根長，干旱脅迫處理24 h和36 h，再從每個處理組各取20個根測定根長，取平均值。根相對伸長率=干旱脅迫處理組根伸長量/對照組根伸長量×100%。

1.2.4 根相對電導率 分別剪取10個根的10 mm根尖，吸干表面水分，稱重后放入三角瓶中，加去離子水，抽真空后靜置6 h，用電導儀測定電導值(S1)。然后封口，置沸水浴中3 min，以殺死根組織，冷卻至室溫，測定電導值(S2)，重復3次。相對電導率=S1/S2×100%。

1.2.5 脯氨酸和丙二醛(MDA)含量 脯氨酸含量采用磺基水楊酸提取，茚三酮比色法測定［16］，重復3次，用ng/g，F(xiàn)W表示;丙二醛含量的測定采用林值芳等［17］的方法，重復3次，用 nmol/g，F(xiàn)W 表示。

數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，其中處理平均數(shù)間的差異顯著性采用Duncan新復極差法進行檢驗(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下黑豆根尖根邊緣細胞(RBCs)數(shù)目的變化

干旱脅迫抑制黑豆根尖RBCs的產生，且脅迫程度越高RBCs數(shù)目越少。圖1看出，24 h時11%和22%PEG處理的RBCs數(shù)目分別比對照組降低了21.6%和30.4%，隨著培養(yǎng)時間延長至36 h時，11%和22%PEG處理的RBCs數(shù)目分別比對照組降低了18.1%和28.8%。各處理下RBCs的數(shù)目隨著時間的延長有不同程度的增加(增加率為35.3% ～38.1%)。其中，與24 h時相比，蒸餾水中培養(yǎng)36 h后RBCs數(shù)量平均增加了1497個，RBCs數(shù)量達4236個，此時RBCs數(shù)目達各處理最高。

圖1 干旱脅迫對黑豆根尖根邊緣細胞數(shù)目的影響Fig.1 Effect of the drought stress on root border cells(RBCs)number in root tips of black soybean

2.2 干旱脅迫對RBCs黏液厚度的影響

露白的黑豆種子經過懸空培養(yǎng)后，收集RBCs并用墨水染色，由于黏液層不能被墨水染色，強光照射下在細胞壁外圍可以觀察到很亮的黏液層(圖2)。干旱處理引起黏液層厚度增加，尤其是22%PEG處理時，厚達細胞直徑的黏液層包裹了整個細胞，長時間(36 h)PEG處理下尤為明顯。

干旱脅迫24 h，11%和22%PEG處理的RBCs黏液厚度分別比對照增加了62.8%和133.8%(圖3)。隨著處理時間延長，蒸餾水處理組黏液變化不明顯，而干旱處理組的黏液進一步增厚，11%和22%PEG處理時黏液層厚度分別比對照增加了140.7%和172.7%。表明干旱脅迫刺激邊緣細胞黏液的產生，脅迫程度越重，脅迫時間越長，黏液產生量越多。

2.3 干旱脅迫下RBCs對黑豆根相對伸長率的影響

干旱脅迫顯著抑制根伸長，脅迫程度越高、培養(yǎng)時間越長，對根伸長的抑制越明顯，差異達顯著水平(圖4)。靜置和振蕩培養(yǎng)24 h，前者的根相對伸長率有高于后者的趨勢。時間延長至36 h，11%PEG處理下兩種培養(yǎng)方式對根相對伸長率無影響，而22%PEG處理時，振蕩培養(yǎng)下的根相對伸長率比靜置培養(yǎng)降低了42.5%。表明PEG處理引起的干旱脅迫對黑豆的根生伸長造成抑制，而長時間缺乏RBCs保護則會增強干旱脅迫的抑制作用。

圖4 干旱脅迫對黑豆根相對伸長率的影響Fig.4 Effect of the drought stress on relative root elongation in black soybean

2.4 干旱脅迫下RBCs對根系生理特性的影響

2.4.1 根系脯氨酸含量 脯氨酸是植物體內重要的滲透調節(jié)物質，其含量在一定范圍內與植物抗逆能力存在相關性。振蕩和靜置培養(yǎng)下黑豆根系脯氨酸含量表現(xiàn)出極顯著差異(P＜0.01)，振蕩培養(yǎng)24 h后根系脯氨酸含量達同處理下靜置培養(yǎng)組的27.2% ～81.8%(表1)。36 h后振蕩培養(yǎng)的各處理根系脯氨酸含量達同處理下靜置培養(yǎng)組的2.8%～92.9%。隨著PEG濃度的升高，脯氨酸含量受抑制程度也增加，尤其是36 h后振蕩培養(yǎng)下PEG處理的根系脯氨酸含量大大下降，這可能與根系結構被破壞、細胞受到損傷有關。

2.4.2 根相對電導率 干旱脅迫下黑豆根相對電導率顯著高于對照組，處理24 h和36 h后分別增加了43.7% ～85.1%和32.1% ～97.9%，PEG處理引起相對電導率的極顯著增加(P＜0.01)(表2)。24 h和36 h時振蕩培養(yǎng)下的根相對電導率高于靜置培養(yǎng)。上述結果說明，干旱培養(yǎng)條件下細胞質膜外滲率增加，除去根尖RBCs和黏液后黑豆根尖受到的損傷更加嚴重。

2.4.3 根系MDA含量 MDA是膜脂過氧化的產物，其含量的增加可作為細胞膜受破壞的標志之一。無論是振蕩還是靜置培養(yǎng)，干旱脅迫顯著提高根尖MDA含量(表2)，增幅達89.9% ～207.0%。兩種培養(yǎng)方式相比，除11%PEG處理24 h外，振蕩培養(yǎng)組的MDA含量均顯著高于相同處理的靜置培養(yǎng)組，該結果與相同處理的根相對電導率變化一致。上述結果表明，干旱脅迫引起黑豆根尖MDA含量的增加，移除根尖RBCs和黏液會導致根尖細胞受損更加嚴重。

表1 干旱脅迫對黑豆根系脯氨酸含量的影響Table 1 Effect of the drought stress on proline content in black soybean

3 討論與結論

大部分植物都有RBCs及其分泌的黏液包裹于根尖，形成套膜結構，在維持干燥土壤的根－土聯(lián)系中起重要作用［18］。黏液的成分主要由兩大類水溶性不同的物質組成［19］:一種是能與Ca2+結合的具有凝膠性質的果膠類物質，由于有半乳糖、鼠李糖、巖藻糖和糖醛酸等的存在，黏液具有親水性和陽離子交換特性［20］;而另一種則為不具凝膠性質的物質。在干燥土壤中，黏液脫水使得RBCs緊緊包裹于根尖周圍［18］，當遇到水時，RBCs又容易從根尖釋放［21］;例如根際土壤干燥時，黏液中的RBCs和其它的高分子量多糖的存在，起到了表面活性劑作用，降低根系周圍的表面張力。同時，黏液中懸浮的根RBCs使黏液具有粘彈性質，吸引土壤顆粒向根表移動，以維持土壤的水連續(xù)性，有利于養(yǎng)分如磷的遷移和吸收［22］;并且土壤干燥和黏液脫水時，黏液粘性增加，均有助于根圈(Rhizosheath)形成［23］，增加根際土壤結構的穩(wěn)定性。

表2 干旱脅迫對黑豆根相對電導率和MDA含量的影響Table 2 Effect of the drought stress on relative electric conductivity and MDA content in black soybean

McCully等人［24］的研究表明，自然干燥后玉米根部黏液具有－11 MPa的水勢。然而，這種干燥的黏液能夠在120 s內迅速吸取水分使其水勢達到0。本文采用PEG模擬干旱脅迫環(huán)境，PEG造成的干旱作用事實上是限制了水分進入根部的速度而引起植物的生理性干旱。有研究證明［25］，黏液中所含相當多的未酯化半乳糖醛酸對水分具有很大的吸附能力，吸水膨脹，能使根部在短時間內吸收大量水分，并且黏液使根尖具有較強的保水能力，使植物根系失水較慢。有早期研究［26］表明，玉米黏液具有集中水分的能力，而水分積聚表現(xiàn)為黏液單位體積的增大。本實驗結果也顯示，干旱脅迫引起黑豆根尖RBCs黏液釋放量增加，保留RBCs及黏液根尖相對電導率和 MDA，均低于移除 RBCs的根尖，說明RBCs和黏液的存在有利于根系抵抗干旱缺水造成的不利影響。RBCs對干旱的響應尤為顯著，干旱脅迫導致RBCs黏液的大量釋放，推測在干旱條件下根尖RBCs通過分泌更多的黏液，增強保水作用，為根部生長保證充足的水分。Read等人［26］的研究發(fā)現(xiàn)，隨著黏液濃度增加，黏液的粘性也逐漸升高。而Watt等人的研究表明，在干旱土壤條件下，禾本科植物根部形成體積大、有粘結性的根套，且根套的形成主要就是通過黏液的粘性作用，這與本文干旱處理導致黏液分泌量增加的結果一致。沙生植物如白沙蒿的果皮外層也具有粘稠的黏液層，該層在遇水后迅速吸水膨脹，同樣有助于干旱和鹽害脅迫下種子的萌發(fā)［27］。

干旱誘導的膜脂過氧化是造成植物細胞膜受到損傷的關鍵因素，而膜傷害是導致植物組織傷害和衰老的重要誘導因素。MDA是反應膜脂過氧化程度的指標，與質膜透性參數(shù)結合可綜合反映植物膜系統(tǒng)的受損程度。本實驗中干旱脅迫導致黑豆根尖的MDA含量和根系電導率大幅度增加(24 h)，尤其是22%PEG處理組，除去RBCs后MDA和根相對電導率增加量高于保留RBCs組，證實除去RBCs后黑豆根尖細胞質膜受到的破壞程度更高。脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，植物受到水分脅迫時它的增加有助于細胞或組織的儲水，防止脫水，這有助于提高其抗旱性。而脯氨酸作為重要的滲透調節(jié)物質，能夠保持原生質和環(huán)境滲透平衡，影響蛋白質穩(wěn)定性，保持膜結構的完整。本文中振蕩培養(yǎng)移除RBCs及黏液后根系的脯氨酸含量遠低于同處理的靜止培養(yǎng)根系，說明根尖保留RBCs有利于根系維持較高的脯氨酸含量，提高保水、減少失水的能力，增強黑豆的抗旱性。

綜上所述，干旱脅迫能減少根尖RBCs的數(shù)目，促進了RBCs的黏液分泌。黑豆根尖RBCs的存在，顯著提高了干旱脅迫下根系的脯氨酸含量，減少了細胞損傷，有利于根系生長，從而提高黑豆的抗旱能力。

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