方迎艷 郭曉磊 馬 麗 高 琴 葉紅偉 關(guān)宿東 (蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030)

內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌功能障礙和肌漿網(wǎng)鈣泵基因表達的變化

方迎艷 郭曉磊 馬 麗1高 琴 葉紅偉 關(guān)宿東 (蚌埠醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，安徽 蚌埠 233030)

目的 探討內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌功能和膈肌肌漿網(wǎng)鈣泵基因(SERCA)表達的變化。方法 直接采用腹腔注射內(nèi)毒素12 mg/kg建立大鼠內(nèi)毒素血癥模型，32只成年雄性SD大鼠隨機分成四組：生理鹽水對照組和內(nèi)毒素24 h組，48 h組，96 h組，即分別在注射內(nèi)毒素24、48、96 h后處死大鼠，應(yīng)用體外灌流大鼠膈肌條的方法，分別測量其單收縮張力(Pt)、最大強直張力(Po)、峰值收縮時間(CT)、半舒張時間(1/2RT)、張力-頻率曲線，電鏡觀察大鼠膈肌超微結(jié)構(gòu)，采用RT-PCR檢測大鼠膈肌SERCA mRNA表達。結(jié)果 大鼠膈肌的各項力學(xué)指標：單收縮張力和最大強直張力，內(nèi)毒素血癥組較對照組明顯降低(P＜0.01);單收縮的峰值收縮時間和半舒張時間，內(nèi)毒素血癥組較對照組明顯延長(P＜0.01);在給予大鼠膈肌條10、20、40、60、100 Hz刺激時，內(nèi)毒素血癥組的大鼠膈肌各頻率下的收縮張力明顯低于對照組(P＜0.01);超微結(jié)構(gòu)顯示內(nèi)毒素對大鼠膈肌組織損傷明顯，肌纖維斷裂，肌漿網(wǎng)擴張，線粒體水腫，數(shù)目減少，脊斷裂，空泡化或囊泡化;RT-PCR檢測實驗結(jié)果提示內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌SERCA表達較對照組明顯降低(P＜0.01)。結(jié)論 內(nèi)毒素可損傷大鼠膈肌超微結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膈肌收縮和舒張功能障礙，并引起膈肌SERCA基因表達明顯降低。

內(nèi)毒素;膈肌;肌漿網(wǎng)鈣泵

膈肌功能障礙在呼吸衰竭中發(fā)揮重要的作用。內(nèi)毒素降低膈肌蛋白質(zhì)合成〔1〕，尤其降低基本的快肌纖維蛋白合成〔2〕，還引起膈肌肌漿網(wǎng)Ca2+釋放機制發(fā)生功能障礙，Ryanodine介導(dǎo)的Ca2+釋放明顯降低〔3〕。本實驗進一步研究內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌超微結(jié)構(gòu)和肌漿網(wǎng)鈣泵(SERCA)基因表達改變，探討內(nèi)毒素血癥中膈肌功能障礙的相關(guān)發(fā)生機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

32只成年雄性SD大鼠隨機分成4組：生理鹽水對照組和內(nèi)毒素24 h組，48 h組，96 h組，即內(nèi)毒素腹腔注射12 mg/kg，分別在注射內(nèi)毒素后 24 h，48 h，96 h 處死大鼠〔4〕。

1.2 藥物和主要試劑

沙門氏菌屬精制內(nèi)毒素L-2880購自Sigma公司;總RNA提取試劑(Trizol)購自Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司;PCR擴增試劑盒購自Fermentas公司;焦碳酸二乙酯(DEPC)上海生工生物工程有限公司;瓊脂糖、EB(溴乙錠)、溴酚藍購自上海生工生物工程有限公司;75%乙醇、冰乙醇均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 主要儀器

生物信號采集處理系統(tǒng)(MedLab-U/4C，南京美易科技有限公司);張力換能器(JZ100，高碑店市新航機電設(shè)備有限公司);透射電子顯微鏡(JEM-1230，日本);GIS凝膠成像分析系統(tǒng)(TanonGIS-1000，上海天能科技有限公司);黑金剛基因擴增儀(EDC-810，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司);多功能暗箱式紫外透射儀(ZF-90型，上海顧材電光儀器廠);瓊脂糖水平電泳槽(DYY-III32型，北京六一儀器廠);電泳儀(DY-A，上海生化所申華生化技術(shù)開發(fā)公司)。

1.4 膈肌標本的處理

水合氯醛麻醉斷頭處死大鼠，速取右側(cè)膈肌，制備膈肌條，剩余取一塊用2.5%戊二醛固定，制備電鏡標本。左側(cè)膈肌在冰生理鹽水漂洗后稱量膈肌100 mg，液氮速凍后在-80℃低溫冰箱中保存待行RT-PCR檢測。

1.5 膈肌超微結(jié)構(gòu)檢測

將膈肌切成1 mm3組織塊，立刻固定到2.5%戊二醛，4℃冰箱保存。1%鋨酸后固定，梯度脫水包埋后，超薄切片(片厚70 nm)，銅網(wǎng)撈片，電子染色(鉛、鈾染色)，用日產(chǎn)JEM-1230型透射電鏡觀察，數(shù)碼相機記錄圖像。

1.6 膈肌力學(xué)指標的檢測

1.6.1 收縮特性〔5〕將置備好的膈肌條垂直懸掛于盛滿Kerb(95%O2和5%CO2)液的麥氏浴槽中，膈肌條的肋骨端用蛙心夾固定在浴槽底部，中心腱端用縫線結(jié)扎并連接于張力換能器。張力換能器固定在微調(diào)節(jié)器上，以便調(diào)節(jié)膈肌肌條的初長度。調(diào)節(jié)肌條長度至產(chǎn)生單收縮力最大時，即肌條處于最適初長度(L0)，將其靜置平衡20 min，各項力學(xué)指標檢測均在L0下進行。麥氏浴槽置于數(shù)控超級恒溫槽中并保持30℃。電子刺激器通過兩根放置在肌條兩側(cè)的鉑金絲電極(電極間距約0.4 cm)以超最大電壓直接刺激膈肌(刺激強度增加至單收縮力最大時，然后再增加至其數(shù)值的130%，即超最大電壓約20 V)。張力傳感器的輸出信號由生物信號采集處理系統(tǒng)記錄分析。每個肌條測定兩次在L0時的單收縮張力(Pt)、峰值收縮時間(CT)、半收縮時間(1/2RT)，每次刺激(刺激參數(shù)：超最大電壓20 V，波寬2 ms)間隔2 min，以兩次平均值作為測定值。

1.6.2 最大強直收縮力(PO) 在單收縮刺激后靜置10 min以超最大電壓，波寬2 ms，串長400 ms，頻率100 Hz刺激獲得一個清晰坪。兩次刺激平均值作為測定值，間隔2 min。

1.6.3 張力-頻率曲線測定〔6〕刺激參數(shù)參照最大強直收縮力的參數(shù)，以 10，20，40，60，100 Hz刺激下的膈肌收縮張力繪出張力-頻率曲線。其值與Pt、PO的值均由膈肌肌條的橫截面積(CSA)標準化后表示(單位：g/cm2)。CSA(cm2)=肌條重量(g)/肌條長度(cm)×膈肌肌肉條密度(g/cm)，膈肌肌肉條密度以1.056 g/cm3計算。

1.7 RT-PCR檢測SERCA mRNA表達的變化

1.7.1 引物序列設(shè)計與合成 通過檢索基因文庫中大鼠目的基因SERCA、與內(nèi)參β-actin的mRNA序列進行引物設(shè)計，引物由上海生工生物工程有限公司合成。大鼠β-actin上游引物：5'-GATGGTGGGTATGGGTCAGAAGGAC-3'下游引物：5'-GCTCATTGCCGATAGTGA TGACT-3'，全長630 bp;SERCA上游引物：5'-AAGCAGTTCATCCGCTACCT-3'下游引物：5'-AGACCA TCCGTCACCAGATT-3'，全長134 bp。

1.7.2 總RNA的提取 取100 mg膈肌組織采用Trizol法提取膈肌肌組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度儀分析A260/A280，要求全部樣本的OD260/OD280比值在1.8～2.0。

1.7.3 RNA的逆轉(zhuǎn)錄與基因擴增 3 μg總RNA行逆轉(zhuǎn)錄。cDNA產(chǎn)物作β-actin、SERCA濃度和循環(huán)梯度周期曲線?？偡磻?yīng)體系 25 μl，包括上述合成的 cDNA 3 μl，PCR Master Mix(2 × )12.5 μl，上、下游引物各 1 μl，加無核酸酶水 7.5 μl。PCR儀上擴增，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min后，以95℃ 50 s變性，β-actin退火溫度59.5℃，50 s;SERCA退火溫度58.2℃，50 s;72℃ 60 s，反應(yīng)30個循環(huán)，最后一輪延伸10 min。PCR產(chǎn)物判定：取5 μl擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳(電壓按100 V，電流40 mA)，EB顯色，結(jié)果使用圖像分析軟件行灰度掃描作半定量分析，以SERCA與β-actin吸光度值的比作為SERCA mRNA表達半定量值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡顯示各組大鼠膈肌超微結(jié)構(gòu)的變化

對照組大鼠膈肌肌纖維密集，排列整齊，肌節(jié)清晰，細胞膜完整，線粒體呈圓形或橢圓形整齊排列，數(shù)量密集，無腫脹。內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌細胞肌纖維腫脹，壞死溶解，橫紋消失，肌絲紊亂;線粒體數(shù)量減少，水腫擴張，線粒體空泡化或囊泡化;肌漿網(wǎng)明顯擴張，腫脹。見圖1。

2.2 膈肌的收縮特性

與對照組相比，內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌的Pt及Po明顯下降(P＜0.01);CT與1/2RT明顯延長(P＜0.01);內(nèi)毒素96 h組與24 h組、48 h組的各項指標有不同程度的差異性(P＜0.05)。見表1。

2.3 膈肌收縮的張力-頻率關(guān)系

在給予大鼠膈肌條10、20、40、60和100 Hz刺激時，內(nèi)毒素血癥大鼠膈肌各頻率下的收縮張力明顯低于對照組(P＜0.01);在100 Hz刺激時，內(nèi)毒素96 h組、48 h組膈肌收縮張力較內(nèi)毒素24 h組出現(xiàn)明顯降低(P＜0.05)。見表2。

2.4 膈肌SERCA mRNA的表達

提取總RNA吸光度(OD260/OD280)的比值為1.8～2.0，純度滿足實驗要求。結(jié)果顯示大鼠膈肌SERCA mRNA/β-actin mRNA的比值，內(nèi)毒素24 h組(0.65±0.12)、48 h組(0.50±0.09)和96 h組(0.42±0.09)較對照組(0.94±0.04)顯著降低(P＜0.01)，見圖2，內(nèi)毒素48 h組和96h組較內(nèi)毒素24 h組也明顯降低(P＜0.01)。見圖2。

表1 各組大鼠膈肌收縮功能的比較(n=8s)

表1 各組大鼠膈肌收縮功能的比較(n=8s)

與對照組比較：1)P＜0.01;與內(nèi)毒素24 h組比較：2)P＜0.05;與內(nèi)毒素48 h組比較：3)P＜0.05;與內(nèi)毒素96 h組比較：4)P＜0.05，下表同

組別 Pt(g/cm2) Po(g/cm2) CT(ms) 1/2RT(ms)對照組 230.59±83.03 865.60±335.71 38.56±5.55 29.69±4.14內(nèi)毒素24 h組 111.33±15.911)4) 550.28±152.601)3)4) 68.00±12.351) 46.26±11.101)3)4)內(nèi)毒素48 h組 91.21±12.421) 351.90±100.471)2) 62.41±6.221)4) 63.20±6.591)2)4)內(nèi)毒素96 h組 56.98±8.071)2) 253.04±59.181)2) 75.13±7.971)3) 80.88±7.641)2)3)

圖1 各組大鼠膈肌超微結(jié)構(gòu)(×20 000)

表2 大鼠膈肌在各刺激頻率下收縮力的變化(g/cm2，n=8±s)

表2 大鼠膈肌在各刺激頻率下收縮力的變化(g/cm2，n=8±s)

組別刺激頻率(Hz)10 20 40 60100對照組 143.99±112.81 245.92±201.85 461.79±144.49789.76±288.68 896.98±269.28內(nèi)毒素24 h組 107.22±45.811) 206.05±104.791) 353.04±61.661) 278.22±17.631) 430.30±62.421)3)4)內(nèi)毒素48 h組 64.21±29.691) 93.07±21.91) 194.83±23.341) 210.52±60.361) 259.80±62.791)2)內(nèi)毒素96 h組 46.09±8.961) 83.48±8.921) 147.89±14.11) 180.49±27.741) 216.93±29.271)2)

圖2 各組大鼠膈肌SERCA mRNA RT-PCR產(chǎn)物電泳凝膠

3 討論

注射內(nèi)毒素可引起大鼠全身功能的損傷，全身炎癥的擴散，造成了各組織器官的嚴重損傷，致使細胞壞死〔7〕。膈肌易受炎癥反應(yīng)影響，內(nèi)毒素可導(dǎo)致大鼠膈肌線粒體腫脹、變形，嵴減少，膈肌收縮力下降〔8〕，并選擇性耗竭膈肌線粒體電子傳遞鏈中關(guān)鍵部位，降低離子泵和ATP的生成〔9〕。本實驗表明，隨著內(nèi)毒素血癥的時間發(fā)展，膈肌收縮和舒張功能明顯下降，膈肌組織超微結(jié)構(gòu)損傷嚴重，肌纖維腫脹，壞死溶解，橫紋消失，線粒體數(shù)量減少，線粒體空泡化或囊泡化。

SERCA是肌漿網(wǎng)中含量最豐富的蛋白，是將 Ca2+轉(zhuǎn)運并釋放到細胞外的一種鈣轉(zhuǎn)運蛋白，從而引起并保持肌肉舒張。當其功能發(fā)生障礙時，細胞 Ca2+轉(zhuǎn)運能力下降引起Ca2+平衡紊亂〔10〕。膈肌力學(xué)指標1/2RT反映肌漿網(wǎng)對Ca2+再攝取的速度;低頻疲勞(即在＜25 Hz電刺激下肌力特別低)主要與肌漿網(wǎng)釋放Ca2+減少，導(dǎo)致肌肉興奮-收縮耦聯(lián)障礙有關(guān)〔6〕。本實驗結(jié)果提示內(nèi)毒素可引起SERCA活性的降低，肌漿網(wǎng)鈣攝取下降，膈肌細胞內(nèi)Ca2+大量聚集，導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣超載，并最終導(dǎo)致膈肌收縮、舒張功能障礙。

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4 Supinski GS，Vanags J，Callahan LA.Effect of proteasome inhibitors on endotoxin-induced diaphragm dysfunction〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2009;296(6)：L994-L1001.

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Dysfunction and changes of gene expression in sarcoplasmic reticulum calcium pump in endotoxin-induced diaphragm

FANG Ying-Yan，GUO Xiao-Lei，MA Li，et al.
Department of Physiology，Bengbu Medical College，Bengbu 233030，Anhui，China

Objective To investigate endotoxemia inducing the changes of diaphragm dysfunction and gene expression in sarcoplasmic reticulum calcium pump in rats.Methods Rats were given saline(0.5 ml ip，saline control group)and endotoxin(12 mg/kg ip，endotoxin group)respectively.Animals were killed at 24，48 and 96 hours after injections.Assessments were made of the diaphragm contractility，such as peak twitch tension(Pt)，maximum tetanic tension(Po)，time to peak contraction(CT)，half relaxation time(1/2RT)and diaphragm force-frequency relationships，and the change of the ultrastructures and the content of sarcoplasmic reticulum calcium pump(SERCA mRNA)was analyzed by reverse transcriptase polymerize chain reactive.Results Compared with control group，Pt and Po of endotoxin group were lower(P＜0.01)，CT and 1/2RT of endotoxin group were significantly longer(P＜0.01);Tetanic force under the stimulus frequency of 10，20，40，60，100 Hz in endotoxin group were decreased significantly(P ＜0.01).Transmission electron microscopic morphometry of diaphragm in endotoxin group revealed diaphragm myoneme confused and broken，sarcoplasmic reticulum was distended，the quantity of mitochondria was decreased，mitochondria edema and expanded，its cristae broken and vague，a great quantity of mitochondria vacuolization or vesiculation.The expression of SERCA mRNA in diaphragm was lower in endotoxin group than that of control group(P＜0.01).Conclusions Endotoxin destroys the diaphragmatic ultrastructure and induces diaphragmatic dysfunction，it could also decrease SERCA mRNA contents.

Endotoxin;Diaphragms;SERCA

R363.2

A

1005-9202(2012)23-5167-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.031

國家自然科學(xué)基金(No.81000074);安徽省教育廳自然科研基金項目(No.KJ2012Z250)

1 蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院感染科

關(guān)宿東(1961-)，男，碩士生導(dǎo)師，教授，主要從事呼吸生理與病理生理學(xué)研究。

方迎艷(1977-)，女，碩士，講師，主要從事呼吸生理與病理生理學(xué)研究。

〔2012-02-28收稿 2012-04-12修回〕

(編輯 曹夢園)