郁曉敏 吳嫻靜 董德坤 朱丹華

(浙江省農業(yè)科學院作物與核技術利用研究所，杭州 31002)

米曲霉發(fā)酵制備大豆肽的分離純化與抗氧化性研究

郁曉敏 吳嫻靜 董德坤 朱丹華

(浙江省農業(yè)科學院作物與核技術利用研究所，杭州 31002)

利用輻照誘發(fā)米曲霉孢子突變，篩選得到酶活力強且特異性高的米曲霉誘變菌株。利用米曲霉誘變菌株對豆腐皮加工后的剩余豆?jié){(下漿水)進行發(fā)酵，制備大豆肽的發(fā)酵液，發(fā)酵液經超濾和凝膠過濾進行分離純化，采用鐵離子還原抗氧化劑能力測定法(FRAP法)和二苯基苦基苯肼法(DPPH法)研究不同相對分子質量大豆肽的抗氧化能力。結果表明，相對分子質量在1 000～10 000范圍內的大豆肽具有很好的抗氧化活性，其中抗氧化性和穩(wěn)定性最好的大豆肽組分的相對分子質量在1 200～1 400之間。

大豆肽 米曲霉 抗氧化性

大豆肽，又稱大豆活性肽或大豆功能多肽，是大豆蛋白水解產生的具有生理活性的小分子短肽鏈，通常由3～10個氨基酸組成，相對分子質量在300～3 000范圍內［1－2］。與大豆蛋白相比，大豆肽無豆腥味，不產生蛋白變性，抗氧化活性顯著，易被消化吸收，具有更豐富的營養(yǎng)特性和生理功能［3－4］。從發(fā)展前景看，大豆蛋白水解生產大豆肽是大豆蛋白深加工的一個重要方向。

米曲霉(Aspergillus oryzae)是一種需氧真菌，穩(wěn)定性高，易培養(yǎng)，能產生酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，其中中性蛋白酶和堿性蛋白酶，能將大分子蛋白質降解成多肽和氨基酸［5］。大豆加工豆腐皮的過程中產生大量剩余豆?jié){——下漿水，平均每生產1.5噸的豆腐皮就產生1噸的下漿水。下漿水中的大豆蛋白和低聚糖含量豐富，其含粗蛋白約為5%［6］。利用米曲霉可降解下漿水開發(fā)高附加值的肽類新產品，通過米曲霉在發(fā)酵過程中利用原料中的糖分、纖維等物質作為營養(yǎng)，分泌產生的蛋白酶水解下漿水中的大豆蛋白，分解產生較小分子質量的肽和氨基酸，提高利用價值。

本研究利用60Co輻照誘變對米曲霉菌株進行篩選，將米曲霉誘變菌株A－9應用于大豆肽發(fā)酵生產;選用豆腐皮加工制作過程中剩余的豆?jié){(下漿水)為發(fā)酵原料;運用超濾技術和凝膠過濾技術分離純化經米曲霉發(fā)酵下漿水的發(fā)酵液，得到大豆肽溶液;采用鐵離子還原抗氧化劑能力測定法(FRAP法)和二苯基苦基苯肼法(DPPH法)測定大豆肽的抗氧化活性，以期增加大豆肽在食品、醫(yī)藥保健品、飼料添加劑等領域的應用，為大豆低值蛋白的加工利用提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種:米曲霉 Asp 3.042(Aspergillus oryzae 3.042)。原始種由浙江省農業(yè)科學院植物保護與微生物研究所提供，經義烏市丹溪酒業(yè)有限公司單胞分離的優(yōu)良菌株。

原料:下漿水(控制固形物質量分數(shù)為15%)，麩皮，蔗糖。

1.2 主要儀器及試劑

Labscale TFF System:美國 Millipore公司;AKTATM Prime Plus:GE Healthcare公司;Bacitracin(桿菌肽):上海鼎國。

1.3 菌種的誘變篩選

米曲霉菌種的誘變篩選參照胡杰等［6］的方法，蛋白酶活力、氨基酸含量、粗肽含量的測定參照郭繼平等［7］的方法。

1.4 大豆肽的制備

米曲霉分級培養(yǎng)與大豆肽發(fā)酵生產參照吳嫻靜等［8］的方法，發(fā)酵液經6 000 r/min離心，取上清液制得大豆肽提取液。

1.5 大豆肽的分離

超濾分離:用10 000、5 000、1 000 u的超濾膜依次分離，收集相對分子質量1 000以下、1 000～5 000、5 000～10 000以及10 000以上的發(fā)酵液(調節(jié)超濾進出溶液的流速，注意超濾膜進出口的壓力大小)。

凝膠色譜分離:凝膠過濾色譜分離參照周媛媛等［9］的方法。

1.6 抗氧化活性測定

FRAP(ferric reducing antioxidant power)法:鐵離子還原抗氧化劑能力(T－AOC)測試盒(南京建成);DPPH(2，2－diphenyl－1－picrylhydrazyl)法:參照張東杰等［10］的方法。

2 結果與討論

2.1 菌種誘變篩選

在不同輻照強度下米曲霉孢子液的致死率試驗中，隨著輻照強度的增加，米曲霉孢子的致死率逐漸升高(表1)。當輻照強度達到625 Gy時，孢子全部都被輻照滅活;而當輻照強度達500 Gy時，孢子致死率為92.5%。致死率超過90%后，菌株的突變頻率增加，誘變產生的特異性菌株增多，較容易篩選到目標性狀。因此，本研究中選用輻照強度500 Gy作為誘變條件，誘發(fā)米曲霉孢子突變，篩選酶活力強、特異性高的米曲霉誘變菌株。

表1 不同輻照強度下米曲霉孢子液的致死率

在輻照強度為500 Gy的條件下，對米曲霉原始菌株Asp3.042孢子液進行誘變，以HE值(透明圈直徑/菌落直徑)作為篩選指標，篩選獲得17個透明圈較原始菌株大的誘變菌株，分別為 A－1、A－2、A－3、……、A－17(表2)。對篩選得到的誘變菌株進行連續(xù)10代的接種培養(yǎng)，17個菌株均沒有發(fā)生菌種衰退，遺傳穩(wěn)定性好。

對初篩得到的17個誘變菌株，接種下漿水發(fā)酵培養(yǎng)基，在相同條件下進行搖瓶培養(yǎng)。除A－2外的16個誘變菌株，其發(fā)酵4 d的蛋白酶酶活力和發(fā)酵8 d的粗肽含量均比原始菌株Asp3.042高(表2)。其中，A－9菌株菌落質地疏松，生長初期呈白色，后期變?yōu)榈G褐色;生長較快，形成綠色孢子體，呈光滑球形;其發(fā)酵4 d的蛋白酶活力比原始菌株 Asp 3.042提高20%，發(fā)酵8 d得到的粗肽質量分數(shù)提高19%;其形態(tài)學特征與原始菌株相同，連續(xù)培養(yǎng)穩(wěn)定性良好。因此，本研究確定米曲霉A－9菌株為最優(yōu)發(fā)酵菌株，進行下一步的大豆肽發(fā)酵生產。

表2 米曲霉誘變菌株的篩選

2.2 超濾分離大豆多肽及抗氧化活性分析

經米曲霉A－9發(fā)酵下漿水的發(fā)酵液，通過離心沉淀收集上清液，得到大豆肽提取液。利用超濾技術［11－12］對收集的提取液進行逐步分離，得到相對分子質量大小不同的4個截留液(相對分子質量＜1 000的截留液Ⅰ、1 000～5 000的截留液Ⅱ、5 000～10 000的截留液Ⅲ、＞10 000的截留液Ⅳ)。截留液I的主要成分是短肽和游離氨基酸;截留液Ⅱ、Ⅲ的成分以多肽和短肽為主;截留液Ⅳ包含未被充分分解的蛋白質、糖類以及懸浮顆粒等。下漿水中的大豆蛋白被米曲霉發(fā)酵過程中產生的蛋白酶分解成多肽和短肽等，使蛋白結構中具有抗氧化能力的基團(如巰基、咪唑基、酚羥基等)暴露出來;這些基團具有清除自由基，抑制氧化降解的作用，從而使大豆肽表現(xiàn)出抗氧化活性。

抗氧化活性主要表現(xiàn)在抑制氧化降解、清除自由基、抑制促氧化劑和還原能力等方面［13－15］。本研究對4個截留液(截留液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)進行抗氧化活性分析，分別測定其鐵離子還原抗氧化劑能力(FRAP法)和DPPH自由基清除能力(DPPH法)(表3)。結果表明，米曲霉發(fā)酵所制的大豆肽具有顯著的還原能力和自由基清除能力，其中截留液Ⅱ和Ⅲ的鐵離子還原抗氧化劑能力和DPPH自由基清除率均顯著高于截留液Ⅰ和Ⅳ。

表3 發(fā)酵液中不同分子質量大小的截留液抗氧化活性比較

由于FRAP法和DPPH法測定抗氧化活性的原理不同，這兩種方法的測定結果也有差異［11］;張東杰等［10］研究經凝膠過濾色譜分離的不同分子質量大豆肽的抗氧化活性，結果表明其中兩個肽組分(SP2和SP3)的DPPH自由基清除率和還原能力不一致。本研究中，截留液II和III的DPPH自由基清除率和鐵離子還原氧化劑能力也不一致。截留液Ⅱ(1 000～5 000)每毫克蛋白的鐵離子還原抗氧化劑能力為4.25 U，DPPH自由基清除率為19.15%;而截留液Ⅲ(5 000～10 000)每毫克蛋白的鐵離子還原抗氧化劑能力為4.65 U，DPPH自由基清除率為16.74%。與截留液Ⅲ相比，截留液II中所含的多肽(或短肽)分子由于肽鏈較短，與DPPH自由基的結合能力可能更強，自由基清除量也可能更大;而在低pH條件(pH 3.6)下，截留液II所含的多肽分子中的巰基等基團不一定能完全有效地還原Fe3+，以致其鐵離子還原氧化劑能力低于截留液Ⅲ。

將截留液放置3～5 d后，截留液II保持淡黃色澄清溶液，未出現(xiàn)沉淀，溶液較穩(wěn)定;截留液Ⅲ則出現(xiàn)蛋白質凝聚，并產生沉淀，穩(wěn)定性較差。根據(jù)抗氧化活性高并且溶液穩(wěn)定性好的標準，截留液Ⅱ能更好地達到應用目標。

2.3 凝膠色譜分離大豆肽及抗氧化活性測定

采用Sephadex G－25凝膠柱(柱子尺寸2.6 cm×100 cm)，進樣量3 mL，流速3 mL/min，對截留液 II(相對分子質量1 000～5 000)進行層析分離及紫外吸收光譜分析。分離過程中，柱壓穩(wěn)定，洗脫中溶液基線平穩(wěn)。經紫外光譜檢測，截留液Ⅱ(1 000～5 000)中主要存在3個波峰(圖1)，其中第2個波峰(保留時間約115 min)的紫外吸收值最大，收集這個峰的洗脫液。在相同的凝膠色譜條件下，桿菌肽(相對分子質量1 422)的保留時間約為95 min(圖1)。洗脫按分子質量大小逐漸分離，分子質量較大的大豆肽先被洗脫出來。因此，洗脫液中多肽的相對分子質量在1 200～1 400之間。

圖1 截留液II和桿菌肽的凝膠過濾色譜

對分離收集的洗脫液進行抗氧化活性分析，該組分中每毫克蛋白的鐵離子還原抗氧化劑能力是4.92 U，DPPH自由基清除率是19.67%。與截留液II相比，經凝膠過濾分離后，洗脫液的抗氧化活性有了提高。結果顯示，在凝膠分離的過程中，截留液中的物質得到分離和純化，其活性隨著純化的進行而不斷提高。洗脫得到的最終組分中，肽成分較純但含量較低，粗肽含量僅為0.16 μg/mL。若能利用制備型高效液相色譜對該組分進行進一步分離回收，然后分析和鑒定大豆肽的氨基酸序列和結構，將更好地促進抗氧化多肽的開發(fā)和制備。

3 結論

通過60Co輻照誘變，本研究篩選得到米曲霉誘變菌株A－9，該菌株經連續(xù)培養(yǎng)未出現(xiàn)衰退，遺傳穩(wěn)定性好，其蛋白酶活力和發(fā)酵產物粗肽含量比原始菌株分別提高20%和19%，適合應用于大豆肽的生產實踐。

由米曲霉發(fā)酵所制的大豆肽提取液中，存在著相對分子質量大小不同的物質，包括未經分解的大豆蛋白、降解得到的大小不一的多肽和短肽、以及游離氨基酸等。大豆肽提取液具有抗氧化活性，通過超濾分離，相對分子質量在1 000～5 000和5 000～10 000的截留液抗氧化活性強于其他區(qū)間(＜1 000或＞10 000)的截留液，其中1 000～5 000的截留液呈淡黃色，溶液放置穩(wěn)定性好，適合應用于抗氧化多肽的開發(fā)與生產。

對截留液(1 000～5 000)進行凝膠過濾分離，洗脫收集具有最大吸光值(保留時間約115 min)的組分，其相對分子質量在1 200～1 400之間。該組分的抗氧化活性比截留液(1 000～5 000)有所提高，說明進一步的分離純化有利于增強其抗氧化活性，使大豆肽具有更為廣闊的應用發(fā)展前景。

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Purification and Antioxidant Activity Determination of Soybean Peptide Fermented from Soy Film By－Products by Aspergillus oryzae

Yu Xiaomin Wu Xianjing Dong Dekun Zhu Danhua
(Institute of Crop and Nuclear Technology Utilization，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310024)

Aspergillus oryzae with strong enzyme activity and high specificity was screened from spore mutation through irradiation.Soybean peptides were made by soy milk remained from soy film by－products and fermented by Aspergillus oryzae.Purification of soybean peptides was then done through ultrafiltration and gel filtration.Antioxidant activity of purified soybean peptides with different molecular weight was determined using FRAP(ferric reducing antioxidant power)and DPPH(2，2 － diphenyl－1 － picrylhydrazyl)methods.The results showed that the sample with molecular weight between 1 000 and 10 000 had better antioxidant activity.The molecular weight of sample that had best antioxidant activity and stability was between 1 200 and 1 400.

soybean peptide，Aspergillus oryzae，antioxidant activity

TQ936

A

1003－0174(2012)03－0020－04

2011－06－24

郁曉敏，男，1979年出生，助研，大豆品質改良

朱丹華，男，1957年出生，研究員，大豆遺傳育種