范勇洪

(平頂山市第一人民醫(yī)院泌尿外科 河南 平頂山 467000)

目前研究認(rèn)為ICCs可能是膀胱慢波活動的起搏器和傳導(dǎo)者。去除了神經(jīng)和體液等干擾因素后離體膀胱平滑肌條,仍可以發(fā)生自發(fā)性興奮和收縮[1]。因此推測:DCP發(fā)病是否與膀胱ICCs樣細(xì)胞的改變有關(guān)。離體的ICCs細(xì)胞在高糖環(huán)境下變化尚未見報(bào)道。本研究通過體外培養(yǎng)、熒光負(fù)載的方法來觀察高糖環(huán)境對ICCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,以探討DCP功能改變的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

12只健康豚鼠。激光共聚焦顯微鏡META 510,膠原酶V(Sigma公司),Fluo－4 AM,葡萄糖,標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清。

1.2 方法

1.2.1 豚鼠膀胱ICCs細(xì)胞的體外培養(yǎng) 脫臼處死豚鼠,無菌手術(shù)取出其膀胱,取肌層并剪成碎塊,膠原酶V消化后,制成無糖DMEM細(xì)胞懸液,接種于培養(yǎng)皿中,37℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24h,棄去皿中培養(yǎng)液,分別加入含5、10、15mmol/L葡萄糖的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液,分別培養(yǎng)24、72h。

1.2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察 Fluo－4AM工作液加入培養(yǎng)好ICCs細(xì)胞培養(yǎng)皿中,入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育40min,除去細(xì)胞外熒光染料,室溫下避光靜置10min。染色好Cajal間質(zhì)細(xì)胞置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。每個樣本隨機(jī)選60個ICCs細(xì)胞,掃描記錄成象。用META自帶分析軟件測量細(xì)胞長度,獲得熒光背景下每個細(xì)胞長度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ICCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

膠原酶消化后的細(xì)胞貼壁生長,倒置顯微鏡下可見典型的ICCs細(xì)胞,形態(tài)基本一致,以胞體為中心的向相反方向延伸的兩個長突起,可有分枝(圖1)。

2.2 免疫熒光染色

ICCs細(xì)胞Fluo－4AM熒光染色,共聚焦顯微鏡下400倍視野可見不同葡萄糖濃度、不同培養(yǎng)時間段的ICCs細(xì)胞,隨葡萄糖濃度的增加和培養(yǎng)時間的延長,ICCs細(xì)胞明顯出現(xiàn)胞體縮小的現(xiàn)象(圖2)。

2.3 ICCs細(xì)胞形態(tài)結(jié)果

參照McClosky[2]的方法,激光共聚焦掃描記錄ICCs細(xì)胞圖片,用META自帶分析軟件測量細(xì)胞長度值,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間比較:24h組和72h組對比,隨葡萄糖濃度增高,ICC細(xì)胞長度明顯縮短(P<0.01)。組內(nèi)比較:5mmol/L組細(xì)胞長度無差異(P>0.05)。10mmol/L組隨培養(yǎng)時間延長細(xì)胞長度增長(P<0.01)。15mmol/L組隨培養(yǎng)時間延長細(xì)胞長度縮短(P<0.01)。

圖1 倒置顯微鏡下ICC樣細(xì)胞(×40)

圖2－A ICC樣細(xì)胞5mol/24h(×400)

圖2－B ICC樣細(xì)胞15mol/72h(×400)

表1 不同濃度不同時間段細(xì)胞長度值比較[(單位μm),()]

表1 不同濃度不同時間段細(xì)胞長度值比較[(單位μm),()]

注:▲▲P<0.01同一濃度間比較;★★P<0.01同一時間間比較

分組 5m m ol 10m m ol 15m m ol 24h 84.63±21.80 (73.71±15.23)▲▲ (67.30±1386)▲▲72h 80.88±20.81 (85.80±18.29)▲▲★★ (58.65±21.49)▲▲★★

3 討論

糖尿病造成多系統(tǒng)病變。DCP是其最常見癥狀。該病病因復(fù)雜,研究發(fā)現(xiàn)DCP存在逼尿肌肌細(xì)胞[3]病變、神經(jīng)退化,突觸和神經(jīng)遞質(zhì)改變、多種因子、受體分布和含量異常[4]等,但仍無法合理解釋DCP的發(fā)病機(jī)制。眾多研究結(jié)果顯示ICCs是膀胱慢波活動的起搏器和傳導(dǎo)者,為我們研究DCP發(fā)病機(jī)制提供了新的思路?；铙w內(nèi)高糖對豚鼠膀胱ICCs的數(shù)量、形態(tài)及其超微結(jié)構(gòu)有影響我們前期已經(jīng)證實(shí),但離體的豚鼠膀胱ICCs在單因素高糖環(huán)境中的改變目前尚未見報(bào)導(dǎo)。

本研研究通過對離體的豚鼠ICCs細(xì)胞培養(yǎng),觀察高糖環(huán)境下ICCs細(xì)胞形態(tài)的變化。結(jié)果顯示5mmol/L濃度環(huán)境下ICCs細(xì)胞長度無明顯差異。當(dāng)葡萄糖濃度升高和培養(yǎng)時間延長,ICCs細(xì)胞長度明顯縮短,只有10mmoL/72h組細(xì)胞長度增長。數(shù)據(jù)分析顯示:正常生理濃度的葡萄糖對ICCs并無影響。10mol/L組24h細(xì)胞長度明顯縮短,72h又增長,可能是高糖刺激ICCs短時間抑制了ICCs的生理功能。隨培養(yǎng)時間延長細(xì)胞功能恢復(fù)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、線粒體腫脹、胞質(zhì)內(nèi)空泡形成等,致使ICCs細(xì)胞體積增大,長度增長,造成其生理功能異常改變。15mol/L組胞體明顯縮短,并隨培養(yǎng)時間延長胞體進(jìn)一步變小,可能是過高濃度的糖對ICCs直接造成破壞,隨培養(yǎng)時間延長過高濃度的糖環(huán)境持續(xù)破壞,線粒體發(fā)生腫脹、空泡樣變甚至溶解,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生脫顆粒,胞質(zhì)廣泛溶解等,導(dǎo)致ICCs細(xì)胞進(jìn)一步縮小縮短致使其結(jié)構(gòu)、功能異常。

本研究結(jié)果提示,高糖環(huán)境與DCP中ICCs功能改變有重要關(guān)系。高濃度長時間的影響,致使ICCs內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞,進(jìn)而造成形態(tài)改變,導(dǎo)致其作為起搏功能及控制肌細(xì)胞運(yùn)動的結(jié)構(gòu)、功能異常,導(dǎo)致膀胱逼尿肌收縮能力異常,臨床出現(xiàn)DCP癥狀。ICCs形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化可能是DCP發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)之一。

[1]Jiang HH,SongB,Lu GS,et al.Loss of ryanodine receptor calcium release channel expression associated with overactive urinary bladder smooth muscle contractions in adetrusor instability model[J].BJU Int,2005,96(3):428～433.

[2]McCloskey KD.Characterization of outward currents in interstitial cells from the guinea pig bladder[J].J Urol,2005,173(1):296～301.

[3]Andersson KE,Arner A.Urinary bladder contraction and relaxation:physiology and pathophysiology[J].Physiol Rev,2004,84:935～986.

[4]Asano T, Saito Y,KawakamI M,et al.Clinical Pharmacology Study Group. Erythrocytic sorbitol contents in diabetic patients correlate with blood aldose reductase protein contents and plasma glucose level, and are normalized by the potent aldose reductase inhibitor fidarestat(SNK-860)[J].Diabetes Comp lications,2004,18(6):336～342.