吳春麗，蔡峰，李光，陳延治

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第四醫(yī)院放療科，沈陽 1 1 0 0 3 2；2.附屬第一醫(yī)院放療科，沈陽 1 1 0 0 0 1）

氟尿嘧啶脫氧核苷（fluorodeoxyuridine，F(xiàn)UDR）是 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）的脫氧核苷衍生物，作用機(jī)制與氟尿嘧啶相似，但其療效是5-Fu的2~3倍，毒性僅為 5-Fu的 1/5~1/6［1］。FUDR 經(jīng)過一步酶促反應(yīng)就轉(zhuǎn)變?yōu)樾剀账岷铣擅福╰hymidylate synthase，TS）的抑制劑——活性型氟苷單磷酸鹽，從而抑制脫氧胸苷酸合成酶，阻斷腫瘤細(xì)胞DNA的合成，而5-Fu在體內(nèi)必須轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的核苷酸才能發(fā)揮其抑制作用。FUDR是目前肝癌、胃腸道腫瘤、乳腺癌、宮頸癌、頭頸部瘤等惡性腫瘤的常用化療藥物，但是關(guān)于FUDR對鼻咽癌放射增敏作用的研究目前暫未見報(bào)道。本研究通過成克隆分析法觀察FUDR對鼻咽癌細(xì)胞系CNE-1的放射增敏作用，同時(shí)和5-Fu作比較。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及試劑

試驗(yàn)所用鼻咽癌高分化鱗癌細(xì)胞系CNE-1，由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所提供。細(xì)胞在37℃、5%CO2、濕度95%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%小牛血清的RPMI 1640（內(nèi)含青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL），在上述培養(yǎng)條件下該細(xì)胞系的倍增時(shí)間為20~24 h。FUDR粉末試劑和5-Fu針劑由浙江海正藥業(yè)提供，使用前均用RPMI 1640稀釋成所需濃度。細(xì)胞毒性分析所用的CCK-8試劑由日本同仁化學(xué)研究提供。流式細(xì)胞術(shù)所用PI染液及RNase酶購自Sigma公司，鼠多克隆抗p53抗體及二抗購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

對照組：未經(jīng)任何處理。單純用藥組：分為FUDR（0.015 mg/mL）組和 5-Fu（0.10 mg/mL）組，為避免藥物本身對細(xì)胞的毒性作用，故采用的濃度均<50%半數(shù)致死濃度（ID50）的1/5。單純照射組：分為 1、2、3、4、6、8、10 Gy 7 個照射劑量組。用藥加照射組：分為FUDR+照射組和5-Fu+照射組，藥物濃度同單純用藥組，照射方法及劑量均同單純照射組。

1.3 照射方法及劑量

采用SIEMENS公司PRIMUS型直線加速器6MV-X射線照射，劑量率200 cGy/min，源皮距100 cm，照射野涵蓋全部培養(yǎng)皿。

1.4 細(xì)胞蛋白提取及Western blot分析

將對照組和單純用藥組細(xì)胞在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后置于冰上，RIPI buffer處理5 min，刮取細(xì)胞裂解液，超聲5 s，12 000 r/min離心10 min移取蛋白上清，BCA方法測定蛋白濃度，配平后進(jìn)行SDSPAGE蛋白電泳分析。鼠抗多克隆抗體p53（1∶500）4℃孵育過夜，二抗抗p53室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法膠片曝光。

1.5 流式細(xì)胞分析

采用美國BD公司FACS Calibur流式細(xì)胞儀，應(yīng)用CellQuest 3.0軟件采集數(shù)據(jù)，應(yīng)用ModiFit LT 3.0軟件進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.6 細(xì)胞生長抑制率測定

細(xì)胞生長抑制率采用CCK法測定。取指數(shù)生長期的CNE-1細(xì)胞，0.25%胰酶消化計(jì)數(shù)后接種于96孔板，每孔接種 100 μL 細(xì)胞懸液（5 000/孔），貼壁培養(yǎng)12 h后，每孔加入10 μL RPMI 1640配置好的FUDR 和 5-Fu，F(xiàn)UDR 濃度分別為 10、2、0.4、0.08、0.016 mg/mL，5-Fu 濃度分別為 25、5、1.0、0.2、0.04 mg/mL，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白孔（單純加入培養(yǎng)液）和對照孔（只加細(xì)胞懸液），培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h后用分光光度儀在450 nm波長處測定吸光度（optical density，OD）值。各濃度藥物對細(xì)胞的抑制率計(jì)算利用如下公式：細(xì)胞增殖抑制率（%）=［1-（實(shí)驗(yàn)組平均OD值-空白組平均OD值）/（對照組平均OD值-空白組平均OD值）］×100。

1.7 集落形成能力測定

按照實(shí)驗(yàn)分組將培養(yǎng)瓶內(nèi)處于指數(shù)生長期的細(xì)胞胰酶消化，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)后逐級稀釋，接種于直徑60 mm一次性培養(yǎng)皿中。用藥加照射組細(xì)胞于照射前1 h分別加藥，照射方法及劑量均同單純放射組，給藥濃度均同單純用藥組。

細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)液，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，需加藥各組照射前1 h分別加入含藥物的培養(yǎng)液5 mL，其余單純加培養(yǎng)液5 mL。照射前均吸出培養(yǎng)液，PBS洗2次，加無血清培養(yǎng)液5 mL，進(jìn)行照射，照射后按照原分組分別加入原培養(yǎng)基，均置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日1次更換培養(yǎng)液，加藥組更換為含藥物培養(yǎng)液，培養(yǎng)14 d后吸去培養(yǎng)液，PBS洗3遍，95%乙醇配制的1%結(jié)晶紫固定染色20 min，計(jì)數(shù)集落克隆數(shù)（含有≥50個細(xì)胞的集落）。本實(shí)驗(yàn)設(shè)3個平行樣重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，結(jié)果取平均值，以對照組克隆形成率為100%，成克隆分析法校正藥物對細(xì)胞產(chǎn)生的毒性?？寺⌒纬陕剩?）＝克隆數(shù)/（接種細(xì)胞數(shù)×對照組克隆形成率）×100。

1.8 流式細(xì)胞分析

取指數(shù)生長期細(xì)胞，消化后制成均勻單細(xì)胞懸液，等量接種于50 mL培養(yǎng)瓶中。實(shí)驗(yàn)分空白對照組、分別加 FUDR 和 5-Fu 后 6、12、18、24 h 組，每組設(shè)3個平行樣。各組處理因素終止后，均棄去培養(yǎng)液，胰酶消化，4℃PBS吹成單細(xì)胞懸液，洗滌離心3次棄上清，-20℃預(yù)冷的70%乙醇4℃固定24 h以上，染色前離心棄上清，PBS垂懸再離心棄上清，500 μL的PBS垂懸，加20 μL的RNase貯存液（10 mg/mL），混勻后37℃水浴作用30 min，離心，PBS洗滌去 RNase，100 μL PBS 垂懸，加 100 μL PI（10 μg/mL）染液，4℃避光30 min后上機(jī)測定。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

根據(jù)單靶多擊數(shù)學(xué)模型利用GraphPad Prism 4軟件擬合細(xì)胞存活曲線，計(jì)算出各組的D0、Dq值和放射增敏比SER（單純照射組D0值與照射加藥組D0值之比）及SER2（照射2 Gy時(shí)的存活分?jǐn)?shù)之比）。SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析所得數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用x±s表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FUDR和5-Fu對CNE-1細(xì)胞生長的毒性作用

根據(jù)FUDR和5-Fu作用24 h后的濃度抑制率曲線（圖1）求出FUDR和5-Fu對CNE-1細(xì)胞的ID50分別為0.078和0.509 mg/mL。

2.2 成克隆分析結(jié)果

從成克隆分析法校正藥物對細(xì)胞毒性作用后的細(xì)胞存活曲線（圖2）得出單純放射組的D0、Dq及5-Fu聯(lián)合放療組與FUDR聯(lián)合放療組的D0、Dq、SER、SER2，見表 1。

2.3 Western blot分析P53在各組細(xì)胞內(nèi)表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，加5-Fu和FUDR組均增加p53蛋白表達(dá)，且以FUDR組增加更明顯。見圖3。

表1 單靶多擊擬和的生物學(xué)結(jié)果及增敏比結(jié)果T a b.1R e s u l t so f b i o l o g ya n ds e n s i t i v i t ye n h a n c e me n t r a t i ob y s i n g l e h i t mu l t i t a r g e t s mo d e l

2.3 流式法測定細(xì)胞周期分布

流式細(xì)胞儀分析藥物對細(xì)胞周期影響的結(jié)果，加藥后不同時(shí)間段各組S期細(xì)胞比例進(jìn)行比較，可見FUDR或5-Fu作用后隨時(shí)間延長S期細(xì)胞明顯增多（P<0.05），但這二者比較作用無明顯差異。見圖4。

3 討論

氟尿嘧啶類藥物是細(xì)胞周期特異性細(xì)胞毒藥物，是多年來在臨床上廣泛應(yīng)用的一類抗腫瘤藥物。FUDR作為5-Fu的升級產(chǎn)物，廣泛應(yīng)用于臨床。近年來FUDR不僅用于治療消化系統(tǒng)腫瘤，還可作為氟尿嘧啶換代產(chǎn)品用于乳腺癌、卵巢癌及肺癌的化療，提高腫瘤化療患者的生活質(zhì)量［2］。鼻咽癌是頭頸部常見腫瘤，發(fā)病原因主要與EB病毒感染有關(guān)［3］，放射治療是鼻咽癌首選治療方法，應(yīng)用放療增敏劑提高鼻咽癌放射治療療效、降低正常組織損傷是目前基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐的迫切需要。已有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UDR與順鉑聯(lián)合放療可以提高鼻咽癌放療敏感性，治療鼻咽癌收到較好療效［4］。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平研究FUDR聯(lián)合放射對鼻咽癌細(xì)胞的增敏作用，從圖1可得出FUDR毒性作用強(qiáng)于5-Fu，其ID50是0.078 mg/mL，低于 5-Fu的 0.509 mg/mL；從圖 2可以看出，在排除藥物毒性作用后，在一定的放射劑量下，與單純照射組相比，F(xiàn)UDR+照射組及5-Fu+照射組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)均顯著下降，其放射增敏比SER分別為1.504和1.159，且FUDR與5-Fu相比有更強(qiáng)的增敏作用。

目前關(guān)于FUDR的放射增敏機(jī)制研究很多，大部分研究顯示FUDR增敏和DNA錯配修復(fù)有關(guān)［5］，且臨床研究已經(jīng)證實(shí)該藥物對肝內(nèi)腫瘤有增敏作用［6］，但其具體機(jī)制仍然不清楚。有研究表明FUDR是通過干擾DNA及RNA，尤其是DNA合成的修復(fù)，殺死對射線抵抗的S期細(xì)胞起作用的［7］。但是本實(shí)驗(yàn)在校正藥物細(xì)胞毒性情況下進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FUDR仍有放射增敏作用。另一項(xiàng)研究結(jié)果表明［8］，F(xiàn)UDR的放射增敏是通過對TS的抑制起作用的，F(xiàn)UDR可以通過代謝產(chǎn)物與TS結(jié)合形成穩(wěn)定的化合物，從而抑制TS，阻斷dUMP向dTMP轉(zhuǎn)化，減少DNA的合成。但是已有的實(shí)驗(yàn)顯示，細(xì)胞在低濃度的FUDR培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 h后，TS已基本受抑制，此時(shí)并沒有顯示出放射增敏效應(yīng)。但若在同樣濃度的FUDR中培養(yǎng)16 h，就表現(xiàn)出顯著的放射增敏效應(yīng)，因此TS被抑制與放射增敏之間的關(guān)系需進(jìn)一步討論。早期研究認(rèn)為［9］，F(xiàn)UDR是通過使細(xì)胞周期重新分布于放射敏感時(shí)相來提高放射敏感性的。但是Michigan大學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用FUDR處理后的S中期細(xì)胞和其他時(shí)相的細(xì)胞放射敏感性相同，故得出結(jié)論FUDR的放射增敏作用可能不是使細(xì)胞周期重新分布于放射敏感的時(shí)相［10］。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UDR和5-Fu作用后各時(shí)間段的S期細(xì)胞增多，而不是放射敏感時(shí)相（G2、M期）的細(xì)胞增多，這與早期Michigan大學(xué)的研究結(jié)果相一致。該機(jī)構(gòu)后來進(jìn)一步研究也證明p53基因突變導(dǎo)致的細(xì)胞周期阻滯與FUDR的放射增敏作用無關(guān)［11］。國內(nèi)已有研究證實(shí)p53蛋白是與鼻咽腫瘤相關(guān)的控制細(xì)胞生長和各種信號通路中最重要調(diào)控因子之一［12］。本研究通過蛋白電泳分析發(fā)現(xiàn)，5-Fu和FUDR作用于細(xì)胞24 h后p53表達(dá)均增加，且FUDR組細(xì)胞增加更顯著，證實(shí)其增敏作用可能與p53有關(guān)，但可能不是通過細(xì)胞周期阻滯，具體機(jī)制需進(jìn)一步研究證實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)UDR對鼻咽癌CNE-1細(xì)胞有較強(qiáng)的放射增敏作用，且其作用強(qiáng)度高于5-Fu，該增敏作用可能與p53信號通路有關(guān)，但與細(xì)胞周期阻滯并無明顯關(guān)系。本研究為FUDR作為鼻咽癌放療增敏劑提供研究基礎(chǔ)，為臨床進(jìn)一步提高鼻咽癌放療療效提供思路。

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