陳傳萍，何群，王邵成，潘忠誠，王天驕，張玉魁，鐘連聲，趙雨杰

（中國醫(yī)科大學生物芯片中心，衛(wèi)生部細胞生物學重點實驗室，沈陽 1 1 0 0 0 1）

CD15是細胞表面糖蛋白或糖脂含有的外鏈巖藻糖化的乙酰乳糖胺糖鏈，作為細胞黏附分子成員，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關［1~4］。CD15s是CD15的唾液酸化形式，通過結合含有選凝素的血小板、粒細胞及內皮細胞促進癌灶細胞轉移［5］。ST3GaL糖基轉移酶在催化CD15s的生物合成中起重要作用［6］。腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是具有廣泛生物學活性的細胞因子［7］，對腫瘤細胞有多向調節(jié)和直接細胞毒作用［8］。肝癌患者血清TNF-α水平隨病情進展明顯上升，隨肝病的有效治療其水平逐漸下降。腫瘤微環(huán)境中低劑量的TNF-α可促進腫瘤細胞的侵襲和轉移［9，10］。提示TNF-α在肝癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉移中起重要作用。研究表明，TNF-α能誘導多種腫瘤中CD分子含量的變化，從而影響細胞生物學功能［11］。本研究擬探討TNF-α對肝癌細胞系CD15、CD15s、ST3GaL糖基轉移酶家族蛋白含量以及細胞侵襲力的影響，闡明TNF-α影響細胞侵襲轉移的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人原發(fā)性肝癌細胞系HepG-2，人高轉移肝癌細胞系SMMC-7721購自南京KeyGEN公司；CD15、CD15s鼠抗人單克隆抗體，Matrix基質膠購自美國BD公司；糖基轉移酶ST3GaL家族：ST3GaL-Ⅰ、ST3GaL-Ⅱ、ST3GaL-Ⅲ、ST3GaL-Ⅳ、ST3GaL-Ⅴ、ST3GaL-Ⅵ兔抗人多克隆抗體購自美國Abcam公司；蛋白內參β-Actin一抗購自Santa Cruz公司；羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP、羊抗鼠IgM-HRP購自博士德公司；凱基全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量檢測試劑盒購自碧云天公司；蛋白彩虹Marker購自Fermentas公司；ECL發(fā)光反應試劑盒購自Thermo公司；人重組TNF-α購自美國Promega公司；Transwell購自Millipore公司（24孔，8 μm孔徑）；RPMI 1640細胞培養(yǎng)基購自美國HyClone Laboratorles公司；優(yōu)級胎牛血清購自天津市灝洋生物制品科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%優(yōu)級胎牛血清、青霉素、鏈霉素100 U/mL），在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)HepG-2和SMMC-7721細胞系。每2~3 d用0.25%胰酶細胞傳代1次。

1.2.2 Western blot檢測：用 20 ng/mLTNF-α 處理對數(shù)生長期的HepG-2及SMMC-7721細胞系0、24、48 h，提取細胞全蛋白，取40 μg行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉膜，5%脫脂奶粉TBS封閉1 h，CD15、CD15s、ST3GaL糖基轉移酶家族蛋白一抗溶液（稀釋200~1 000倍）室溫下振蕩孵育2 h，加入辣根過氧化物酶標記的二抗溶液（稀釋5 000倍），室溫下振蕩孵育1.5 h。ECL發(fā)光反應，照相分析，采用Quantity One軟件分析灰度值，β-actin用作內參照，實驗重復3次。

1.2.3 Transwell法：取對數(shù)生長期HepG-2、SMMC-7721細胞，接種于6孔板（2×104/孔），24 h貼壁后換液，加入含 TNF-α（終濃度 20 ng/mL）的培養(yǎng)基，24 h和48 h后，用膠原酶消化，離心洗滌并重懸于無血清培養(yǎng)基中，調整細胞密度為5×105/mL，取200 μL接種于Transwell小室的上室（24孔板），下室加入含10%新生小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2濕化孵箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，棉簽擦凈Transwell膜上室面細胞，4%多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色25 min，200倍光鏡下計數(shù)上、下、左、右、中5個不同視野穿過膜的細胞數(shù)，取均值，以遷移的細胞數(shù)表示腫瘤細胞的侵襲能力。設3個平行小室，重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗，Transwell實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TNF-α對HepG-2細胞中CD15和CD15s含量的影響

用 TNF-α 分別作用 HepG-2細胞 24、48 h，CD15含量逐漸下降，CD15 s含量逐漸上升，變化呈時間依賴性。與0 h組比較，48 h組CD15含量明顯下調（P<0.05），CD15s含量明顯上調（P<0.05）。見圖1。

2.2 TNF-α對SMMC-7721細胞中CD15及 CD15s含量的影響

TNF-α分別作用SMMC-7721細胞24 h和48 h，CD15及CD15s含量較0 h組均無明顯變化（P>0.05）。見圖 2。

2.3 TNF-α對HepG-2細胞中ST3GaL糖基轉移酶家族蛋白表達的影響

TNF-α作用HepG-2細胞48 h，ST3GaL糖基轉移酶家族蛋白（Ⅰ~Ⅳ）中ST3GaL-Ⅱ和ST3GaL-Ⅳ的表達較對照組明顯上調（P<0.05），其他4種ST3GaL糖基轉移酶的表達無明顯變化（P>0.05）。見圖3。

2.4 TNF-α對HepG-2和SMMC-7721細胞侵襲力的影響

Transwell結果顯示：TNF-α作用24 h組HepG-2細胞的穿膜細胞數(shù)（61.7±10.4）略高于無藥物處理對照組（48.3±5.77），差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；TNF-α作用48 h組HepG-2細胞的穿膜細胞數(shù)（106.7±17.56）明顯高于無藥物處理對照組（48.3±5.77），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示此時HepG-2細胞侵襲力顯著增強。見圖4A。

TNF-α作用24 h組及48 h組SSMC-7721細胞的穿膜細胞數(shù)（100±11.36，105±13.23）較無藥物處理組穿膜細胞數(shù)（90±10.0）均無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。見圖 4B。

3 討論

細胞黏附分子作為介導細胞與細胞或細胞與基質相互識別和作用的分子，在腫瘤細胞的侵襲和轉移過程中發(fā)揮著雙重作用：一方面腫瘤細胞首先通過黏附分子表達下調，從原發(fā)灶脫落，另一方面又需要通過細胞外基質受體或內皮細胞配體的表達上調，與細胞外基質或血管內皮細胞黏附而移動，才能發(fā)生轉移［12，13］。研究表明，細胞黏附分子的表達易受細胞因子的作用。細胞因子TNF-α可誘導多種腫瘤細胞，如乳腺癌、胰腺癌等的細胞黏附分子CD44的表達上調［11，14］。本研究首次發(fā)現(xiàn)：TNF-α 同樣可使原發(fā)性肝癌細胞系HepG-2中細胞黏附分子CD15s含量增加，同時使CD15含量下降。CD15和CD15s需要經(jīng)過1個共同的前體并通過2條途徑分別合成［15］，而ST3GaL糖基轉移酶家族蛋白在催化CD15s的生物合成中起重要作用［6，16］。為了進一步探討TNF-α誘導CD15及CD15s含量變化的原因，我們應用Western blot檢測了TNF-α作用后HepG-2細胞系中ST3GaL糖基轉移酶家族蛋白相關成員的表達，發(fā)現(xiàn)ST3GaL-Ⅱ和ST3GaL-Ⅳ表達明顯上調，而其他成員的表達無明顯改變。我們推測ST3GaL-Ⅱ和ST3GaL-Ⅳ的上調可能使前體偏向CD15s生物合成途徑，增加了CD15s含量，同時偏離CD15合成途徑使CD15的合成減少。本研究結果還顯示，SMMC7721細胞中CD15和CD15s的含量無明顯改變，推測其原因可能是由于該細胞中CD15和CD15s含量已接近飽和狀態(tài)。

腫瘤微環(huán)境中低劑量的TNF-α能促進卵巢癌、人類黑色素瘤等多種腫瘤細胞侵襲［9，10］。本研究發(fā)現(xiàn)，HepG-2細胞中，TNF-α在誘導CD15和CD15s含量變化的同時，能促進細胞侵襲；但在SMMC-7721細胞中，TNF-α作用后，無論是CD15和CD15s含量還是細胞侵襲力均無明顯改變。通過比較我們推測TNF-α誘導CD15s上調及CD15下調可能是其促進肝癌侵襲轉移的一個重要機制。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞中CD15表達異常導致細胞黏附的改變是介導腫瘤侵襲轉移的一個重要機制［17］，CD15s上調則與腫瘤侵襲呈明顯正相關［18，19］。谷化平等［20］發(fā)現(xiàn)，在伴有淋巴結轉移的乳腺癌組織中，CD15s陽性率為90.2%，顯著高于無淋巴結轉移組（67.4%，P<0.05），提示CD15s對判斷腫瘤惡性程度和預測淋巴結轉移狀況是一個具有實用價值的標志物。

綜上所述，本研究結果提示：TNF-α可提高原發(fā)性肝癌細胞系HepG-2細胞侵襲轉移能力，調控HepG-2中CD15和CD15s的含量，使CD15s上調，CD15下調。而TNF-α通過何種途徑調控CD15及CD15s含量變化進而影響腫瘤細胞侵襲和轉移的機制尚不明確。我們將進一步探討相關機制，為臨床上研發(fā)新的抑制腫瘤侵襲和轉移的靶向藥物提供理論依據(jù)。

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