謝菊華，韓芳，石玉秀

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，沈陽 1 1 0 0 0 1）

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙（posttraumatic stress disorder，PTSD）是指經(jīng)歷了巨大生命威脅或?qū)ι硇挠袊?yán)重?fù)p害事件后發(fā)生的一系列精神心理綜合征［1］，目前發(fā)病機(jī)制尚不清楚。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白（glucose-regulated protein，GRP）94屬于熱休克蛋白90家族，是常見的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶，在鈣穩(wěn)態(tài)維持，蛋白質(zhì)合成、降解，啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激—未折疊蛋白反應(yīng)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路細(xì)胞凋亡上具有重要作用［2，3］。本研究擬采用免疫組織化學(xué)、Western blot、RT-PCR方法檢測(cè)PTSD大鼠海馬神經(jīng)元GRP94的表達(dá)變化，旨在為進(jìn)一步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路細(xì)胞凋亡在PTSD發(fā)病機(jī)制中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物及分組：健康成年雄性Wistar大鼠45只（中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），體質(zhì)量150~220 g，平均（180±20）g。常規(guī)喂養(yǎng) 7 d 后，隨機(jī)分為正常對(duì)照（nd）組、SPS模型 7 d（sps-7d）組、SPS模型 14 d（sps-14d）組，每組各 15 只。

1.1.2 單一延長應(yīng)激（single-prolonged stress，SPS）模型制備［4］：將大鼠頭朝瓶嘴固定于塑料瓶中，尾巴暴露在外，膠帶捆緊，水平放置禁錮2 h。拆除塑料瓶，直接將大鼠投入水深 30 cm、水溫（24±2）℃的矩形水槽中，計(jì)時(shí)20 min。讓大鼠休息15 min后，置入乙醚缸內(nèi)麻醉至意識(shí)喪失。隨后將大鼠放回籠中，常規(guī)飼養(yǎng)至取材。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化：每組各取大鼠5只，常規(guī)0.4%戊巴比妥腹腔麻醉后暴露心臟，于左心室插管，并剪開右心耳，用37℃預(yù)熱的0.9%氯化鈉溶液灌流沖洗血道至流出液無色。隨后用4%多聚甲醛灌流固定至大鼠四肢僵直、肝臟發(fā)硬。取出大鼠腦組織，4%多聚甲醛后固定至少12 h。常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片待用（厚度 7 μm）。60℃烤片 2 h；脫蠟、梯度乙醇；用30%過氧化氫（1份）+蒸餾水（10份）去除內(nèi)源性過氧化物酶；0.3%Triton洗10 min；枸櫞酸/枸櫞酸鈉緩沖液高壓熱修復(fù)2.5 min；0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次；滴加5%BSA，20 min后分別滴加兔來源多克隆GRP94一抗（Santa Cruz Biotechnology，美國，1︰200稀釋），4℃過夜；0.01 mol/L PBS液漂洗 5 min×3次后滴加二抗（武漢博士德SABC試劑盒），37℃恒溫箱中孵育30 min；0.01 mol/L PBS液漂洗5 min×3次后滴加HRP標(biāo)記的SABC孵育20 min，洗滌，DAB顯色，脫水、透明、封片，于光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，BX60，日本）下觀察并照相。以 Meta－Morph/DPIO/BX41形態(tài)學(xué)圖象分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行圖像積分光密度（integral optical density，IOD）半定量分析。

1.2.2 Western blot：每組取5只大鼠，快速斷頭，冰上取海馬。勻漿、超聲粉碎后，于4℃下12 000 r/min離心30 min，取上清，-20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)Bradford法檢測(cè)蛋白濃度，取50 μg樣品蛋白于12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉常溫?fù)u床封閉2 h。加入一抗（GRP94一抗：Santa Cruz Biotechnology，美國，兔來源多克隆抗體，1︰200稀釋；GAPDH一抗：北京中杉金橋公司，兔來源多克隆抗體，1︰500稀釋）4℃過夜；常溫下復(fù)溫30 min后，TBST洗15 min×3次，HRP標(biāo)記的二抗（均為北京中杉金橋，羊抗兔，1︰2 000）常溫下孵育2 h；TBST洗15 min×3次，ECL顯色，圖像分析。采用Image J分析軟件進(jìn)行蛋白水平半定量分析。每組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，取平均值。目的條帶與內(nèi)參照蛋白GAPDH平均灰度值比值即GRP94/GAPDH蛋白水平。

1.2.3 RT-PCR：每組取5只大鼠，冰上直接斷頭取海馬組織。按Trizol試劑盒說明書提取總RNA，測(cè)定濃度和純度，依據(jù)RT-PCR試劑盒（TaKaRa公司，美國）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)Prime 5.0軟件設(shè)計(jì)出GRP94引物序列：上游5′-GACGGGCAAGGACATT ACAAA-3′，下游 5′-CTTCTTCTTCTGCCCCTGCGTC TG-3′，擴(kuò)增片段長度362 bp，退火溫度為56℃，循環(huán)次數(shù)30次。內(nèi)參照β-actin引物序列：上游5′-ATCACCCACACTGTGCCCATC-3， 下 游 5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGA-3′，擴(kuò)增片段長度542 bp，退火溫度為58℃，循環(huán)次數(shù)30次。取PCR產(chǎn)物5 μL行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，用天能2500R凝膠成像分析儀進(jìn)行成像、數(shù)據(jù)分析。mRNA相對(duì)定量為PCR產(chǎn)物掃描值與β-actin掃描值的比值。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料用x±s表示，組間采取單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

GRP94免疫組化陽性產(chǎn)物主要表達(dá)于神經(jīng)元核周質(zhì)中，為棕黃色。nd組、sps-7d組和sps-14d組免疫組化結(jié)果如圖1所示：SPS模型大鼠GRP94蛋白的表達(dá)在建模后第7天有明顯升高（IOD：11.63±1.77，P<0.05），；第 14天時(shí)表達(dá)降低（IOD：6.96±1.89，P<0.05），但仍較正常 IOD 水平（6.05±1.85）稍高。

2.2 Western blot結(jié)果

GRP94蛋白分子量約為94 kDa，GAPDH蛋白分子量約為36 kDa。建立SPS模型后第7天，GRP94相對(duì)表達(dá)量（0.59±0.03）明顯高于正常對(duì)照組（0.27±0.03）（P<0.05）；建模后第 14 天，GRP94相對(duì)表達(dá)量（0.41±0.02）明顯低于第 7天（P<0.05）。見圖2。

2.3 RT-PCR結(jié)果

RT-PCR結(jié)果顯示：sps-7d組GRP94mRNA相對(duì)表達(dá)量（0.88±0.07）較 nd組（0.32±0.04）明顯升高（P<0.05，圖 3），sps-14d 組相對(duì)表達(dá)量（0.44±0.09）較sps-7d組明顯降低（P<0.05），但未恢復(fù)nd組水平。

3 討論

隨著國內(nèi)外自然災(zāi)害、恐怖襲擊等重大突發(fā)事件的增加，PTSD發(fā)病率顯著上升。據(jù)流行病學(xué)研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國汶川地震損害嚴(yán)重的地區(qū)PTSD發(fā)生率高達(dá)45.5%，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過伊拉克戰(zhàn)爭(zhēng)中戰(zhàn)士PTSD的發(fā)生率（12.2%）［5］。PTSD已成為關(guān)系社會(huì)公眾健康的重要的公共衛(wèi)生問題［6］，因此，PTSD發(fā)病機(jī)制的研究備受國內(nèi)外關(guān)注。

目前許多臨床影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn)PTSD發(fā)病與海馬體積縮小有關(guān)，PTSD發(fā)病可能是海馬神經(jīng)元遭遇巨大損害后自身修復(fù)障礙并最終引起細(xì)胞凋亡所致［7~9］。鑒于PTSD發(fā)病與巨大應(yīng)激源刺激相關(guān)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境變化最為敏感，我們推測(cè)引發(fā)PTSD的巨大應(yīng)激源可能通過觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制、激活未折疊蛋白反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自穩(wěn)功能失調(diào)，最終可能啟動(dòng)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路細(xì)胞凋亡而致海馬神經(jīng)元死亡、海馬體積縮小。GRP94是常見的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶之一，屬于熱休克蛋白90家族。GRP94在蛋白質(zhì)合成、分泌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及抑制鈣離子耗竭中起重要作用［10］，它通過感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活信號(hào)，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)、結(jié)合錯(cuò)誤折疊蛋白及未折疊蛋白，用以應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、協(xié)助蛋白質(zhì)的正確折疊，同時(shí)，GRP94在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致細(xì)胞死亡中也發(fā)揮了一定的抗凋亡作用［11，12］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：經(jīng)禁錮、強(qiáng)迫游泳、乙醚麻醉后常規(guī)喂養(yǎng)7 d的Wistar大鼠海馬錐體細(xì)胞中GRP94蛋白陽性表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯增加（P<0.05）；sps-7d組大鼠海馬GRP94mRNA表達(dá)量相對(duì)增多（P<0.05），提示PTSD大鼠海馬神經(jīng)元確實(shí)發(fā)生了GRP94的表達(dá)改變，這種改變可能與海馬神經(jīng)元啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP94轉(zhuǎn)錄與翻譯水平均反應(yīng)性增加有關(guān)。而SPS14 d后GRP94蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），mRNA表達(dá)也相對(duì)減少（P<0.05），但仍稍高于正常水平，這可能與海馬神經(jīng)元無法通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激恢復(fù)細(xì)胞損傷，神經(jīng)元功能受損，蛋白質(zhì)合成減少及細(xì)胞自穩(wěn)調(diào)節(jié)機(jī)制異常有關(guān)。同時(shí)也說明GRP94可能參與了PTSD大鼠海馬神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后的功能自我修復(fù)，可能是SPS刺激后海馬神經(jīng)元功能難以修復(fù)后引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)徑路細(xì)胞凋亡、海馬體積縮小的重要分子機(jī)制。

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